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柑桔是重要的水果作物，其栽培面积和产量均居世界水果之首。由柑桔黄单胞菌柑桔亚种(Xanthomonas citrissp.citri，简称Xcc)引起的柑桔溃疡病(citrus canker)是一种极具破坏性的细菌性病害，给柑桔产业造成巨大的经济损失，严重制约了柑桔产业的发展。植物NADPH氧化酶由rboh(respiratory burstoxidase homologs)基因编码，是哺乳动物巨噬细胞 gp91PHOX的同源基因，位于质膜或吞噬体小膜上，是膜氧化还原系统的重要组成部分之一，能催化电子从还原型辅酶Ⅱ (NADPH)转移给氧分子(O2)，形成超氧阴离子自由基(O2?–)，随后迅速被歧化为过氧化氢(H2O2)。有研究报道H2O2的浓度可能与抗病性有关，而NADPH氧化酶被认为是植物防御反应中活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生的主要来源之一。rboh通常以基因家族的形式存在，响应多种非生物和生物胁迫，功能多样且存在冗余，然而有关柑桔rboh基因及其在防御反应中的功能仍罕见报道。
本研究以抗病品种金柑(Fortunella margarita)和感病品种葡萄柚(Citrus paradisi)为研究对象，通过比较金柑和葡萄柚中6个Csrboh基因对Xcc的响应，发现CsrbohA和CsrbohD为差异表达基因，经pCLBV介导的VIGS(virus induced gene silencing)技术进一步验证二者对Xcc的响应，最后利用酵母双杂交技术对CsRBOHA和CsRBOHD进行互作蛋白的筛选与验证。
主要研究结果如下：
1、金柑和葡萄柚中分别接种Xcc7dai(days after inoculation)，葡萄柚上的症状更为明显，其Xcc菌群数量高出金柑约2个数量级。正常情况下，金柑中H2O2含量高于葡萄柚；Xcc诱导下金柑中H2O2含量始终高于对照组，而葡萄柚中H2O2含量仅在 1-4 dai 时期高于对照组。当用 NADPH 氧化酶抑制剂 DPI (diphenyleneiodonium chloride)预处理叶片后，金柑和葡萄柚的发病情况均明显加重， Xcc菌群数量高出未处理组约2个数量级，且H2O2含量明显低于未处理组。说明NADPH氧化酶参与了Xcc诱导金柑和葡萄柚产生H2O2。
2、本研究通过生物信息学检索在华中农大甜橙数据库和JGI甜橙数据库中均检索到7个Csrboh相关基因。经Blast分析，其中6个比中predicted-Csrboh基因，其余1个比中predicted-Csrboh-A-like。根据blast结果，将这6个Csrboh基因命名为CsrbohA、CsrbohB、CsrbohC、CsrbohD、CsrbohE和CsrbohH，并通过PCR和序列比对证实在金柑和葡萄柚中确有这6个Csrboh基因。通过SMART分析，发现6个Csrboh基因均具有典型NADPH氧化酶分子特征，包括1个NADPH oxidase、1个FAD-binding，1个NAD-binding结构域，1个Ferric-reduct和0-2个EF-hand结构域。
通过分析Xcc诱导下6个Csrboh基因的表达模式，发现CsrbohA和CsrbohD在金柑、金秋砂糖桔、沃柑和葡萄柚中均显著上调表达，这说明CsrbohA和CsrbohD对Xcc的响应可能具有普遍性。相关性分析结果表明，CsrbohD的表达水平与品种抗性呈显著弱相关关系(rs=0.357, P<0.05)。
3、本研究通过对pTRV、pFGC5941、pCLBV和pCAMBIA2301四个载体的筛选和优化，在前人研究的基础上，集成建立了柑桔叶斑驳病毒(Citrusleaf blotch virus, CLBV)介导的柑桔 VIGS 体系，并利用该体系有效地沉默了金柑和葡萄柚的CsrbohA/D基因。VIGS结果显示，CsrbohD基因的沉默使葡萄柚先于未沉默植株发病，且Xcc菌群数量更多，症状更为明显；CsrbohA基因的沉默使金柑和葡萄柚更为抗病，当未沉默植株的接种部位表现出黄色油渍状斑点和部分浅黄色海绵状隆起等Xcc典型症状时，CsrbohA沉默的金柑和葡萄柚没有明显的症状表现。说明CsrbohD为Xcc抗病相关基因，CsrbohA为Xcc易感相关基因。
4、本研究建立了柑桔膜蛋白酵母双杂交文库，并以CsRBOHA和CsRBOHD为诱饵蛋白，对文库进行筛选，分别发现 40 个和 34 个初始阳性克隆可以不同程度地激活报告基因HIS3、ADE2和LacZ。经DNA测序和比对，去除重复蛋白，共获得 35 个潜在的互作蛋白，其中 16 个与 CsRBOHA 潜在互作关系，20 个与CsRBOHD潜在互作。通过生物信息学分析发现其中4个蛋白可能参与抗病反应，分别为类受体激酶蛋白SOBIR1(C. sinensisleucine-rich repeat receptor-like serine/threonine/tryosine-protein kinase SOBIR1)、抗病蛋白RPP13(C.sinensisputative disease resistance RPP13-like protein 1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶At1g54610(C. sinensisprobable serine/theronine-protein kinase At1g54610)和抗稻瘟病蛋白Pi21(C. sinensisprotein pyricularia oryzae resistance 21-like)。通过RT-qPCR对pCLBV-CsrbohA沉默的金柑和葡萄柚中这4个病程相关蛋白进行了mRNA水平的检测，结果显示CsrbohA沉默的金柑和葡萄柚中这3个抗病相关基因（其中RPP13检测失败）都受 Xcc 诱导上调表达。随后从中选择参与抗病反应的类受体激酶蛋白SOBIR1和一个同时与CsRBOHA和CsRBOHD均潜在互作的膜转运蛋白PTL3 (C. sinensispatellin-3)，通过双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)在本氏烟(Nicotiana benthamiana)上对潜在的互作关系进行验证。结果显示， SOBIR1与CsRBOHA存在互作关系，PTL3与CsRBOHA和CsRBOHD均存在互作关系，扩充了CsRBOHA/D的蛋白互作网络。
本研究以抗病品种金柑(Fortunella margarita)和感病品种葡萄柚(Citrus paradisi)为研究对象，通过比较金柑和葡萄柚中6个Csrboh基因对Xcc的响应，发现CsrbohA和CsrbohD为差异表达基因，经pCLBV介导的VIGS(virus induced gene silencing)技术进一步验证二者对Xcc的响应，最后利用酵母双杂交技术对CsRBOHA和CsRBOHD进行互作蛋白的筛选与验证。
主要研究结果如下：
1、金柑和葡萄柚中分别接种Xcc7dai(days after inoculation)，葡萄柚上的症状更为明显，其Xcc菌群数量高出金柑约2个数量级。正常情况下，金柑中H2O2含量高于葡萄柚；Xcc诱导下金柑中H2O2含量始终高于对照组，而葡萄柚中H2O2含量仅在 1-4 dai 时期高于对照组。当用 NADPH 氧化酶抑制剂 DPI (diphenyleneiodonium chloride)预处理叶片后，金柑和葡萄柚的发病情况均明显加重， Xcc菌群数量高出未处理组约2个数量级，且H2O2含量明显低于未处理组。说明NADPH氧化酶参与了Xcc诱导金柑和葡萄柚产生H2O2。
2、本研究通过生物信息学检索在华中农大甜橙数据库和JGI甜橙数据库中均检索到7个Csrboh相关基因。经Blast分析，其中6个比中predicted-Csrboh基因，其余1个比中predicted-Csrboh-A-like。根据blast结果，将这6个Csrboh基因命名为CsrbohA、CsrbohB、CsrbohC、CsrbohD、CsrbohE和CsrbohH，并通过PCR和序列比对证实在金柑和葡萄柚中确有这6个Csrboh基因。通过SMART分析，发现6个Csrboh基因均具有典型NADPH氧化酶分子特征，包括1个NADPH oxidase、1个FAD-binding，1个NAD-binding结构域，1个Ferric-reduct和0-2个EF-hand结构域。
通过分析Xcc诱导下6个Csrboh基因的表达模式，发现CsrbohA和CsrbohD在金柑、金秋砂糖桔、沃柑和葡萄柚中均显著上调表达，这说明CsrbohA和CsrbohD对Xcc的响应可能具有普遍性。相关性分析结果表明，CsrbohD的表达水平与品种抗性呈显著弱相关关系(rs=0.357, P<0.05)。
3、本研究通过对pTRV、pFGC5941、pCLBV和pCAMBIA2301四个载体的筛选和优化，在前人研究的基础上，集成建立了柑桔叶斑驳病毒(Citrusleaf blotch virus, CLBV)介导的柑桔 VIGS 体系，并利用该体系有效地沉默了金柑和葡萄柚的CsrbohA/D基因。VIGS结果显示，CsrbohD基因的沉默使葡萄柚先于未沉默植株发病，且Xcc菌群数量更多，症状更为明显；CsrbohA基因的沉默使金柑和葡萄柚更为抗病，当未沉默植株的接种部位表现出黄色油渍状斑点和部分浅黄色海绵状隆起等Xcc典型症状时，CsrbohA沉默的金柑和葡萄柚没有明显的症状表现。说明CsrbohD为Xcc抗病相关基因，CsrbohA为Xcc易感相关基因。
4、本研究建立了柑桔膜蛋白酵母双杂交文库，并以CsRBOHA和CsRBOHD为诱饵蛋白，对文库进行筛选，分别发现 40 个和 34 个初始阳性克隆可以不同程度地激活报告基因HIS3、ADE2和LacZ。经DNA测序和比对，去除重复蛋白，共获得 35 个潜在的互作蛋白，其中 16 个与 CsRBOHA 潜在互作关系，20 个与CsRBOHD潜在互作。通过生物信息学分析发现其中4个蛋白可能参与抗病反应，分别为类受体激酶蛋白SOBIR1(C. sinensisleucine-rich repeat receptor-like serine/threonine/tryosine-protein kinase SOBIR1)、抗病蛋白RPP13(C.sinensisputative disease resistance RPP13-like protein 1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶At1g54610(C. sinensisprobable serine/theronine-protein kinase At1g54610)和抗稻瘟病蛋白Pi21(C. sinensisprotein pyricularia oryzae resistance 21-like)。通过RT-qPCR对pCLBV-CsrbohA沉默的金柑和葡萄柚中这4个病程相关蛋白进行了mRNA水平的检测，结果显示CsrbohA沉默的金柑和葡萄柚中这3个抗病相关基因（其中RPP13检测失败）都受 Xcc 诱导上调表达。随后从中选择参与抗病反应的类受体激酶蛋白SOBIR1和一个同时与CsRBOHA和CsRBOHD均潜在互作的膜转运蛋白PTL3 (C. sinensispatellin-3)，通过双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)在本氏烟(Nicotiana benthamiana)上对潜在的互作关系进行验证。结果显示， SOBIR1与CsRBOHA存在互作关系，PTL3与CsRBOHA和CsRBOHD均存在互作关系，扩充了CsRBOHA/D的蛋白互作网络。