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柚皮素(Naringenin，NAR)，是广泛存在于天然植物、蔬菜和水果中的黄酮类化合物。大量研究表明，柚皮素有着抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗心血管疾病等多种药理作用。对柚皮素的生物利用度研究结果表明，柚皮素的生物利用度较低(原形柚皮素的绝对生物利用度仅为3.37％，以结合型柚皮素计算为24.12％)，主要原因为首过代谢较强。我们的研究表明，柚皮素在肠道的首过代谢较强。但柚皮素在肝脏的首过代谢还不清楚。本项目研究目的是利用大鼠离体肝脏灌流技术、大鼠原代肝细胞技术、以及大鼠体内实验分别从器官水平、细胞水平以及整体动物水平来研究考察柚皮素在大鼠肝脏的首过代谢效应。研究结果有助于解释柚皮素生物利用度较低的原因，为柚皮素的进一步开发利用提供参考。
一、大鼠生物样品中柚皮素LC/MS/MS分析方法的建立
建立并验证生物样品中柚皮素的灵敏、特异、可靠、线性范围广的LC/MS/MS分析方法。生物样品采用乙酸乙酯液．液萃取法进行抽提，内标为橙皮素(Hesperetin)。采用液相色谱．串联质谱方法检测。离子源为电喷雾离子化源(ESI)；检测方式为负离子检测；扫描方式采用多反应监测(MRM)，用于定量分析的离子反应分别为m/z 271.1→151.0(柚皮素)和m/z 301.1→164.0(橙皮素)。色谱分析柱为Hypersil BDS C]s柱(2.1mm×100 mm，3 μm)；流动相为甲醇一水(70：30，v/v)；流速为200 μl/min；每个样品的分析时间为2.5 min。分析方法的定量下限为1.0 ng/ml，各生物样品中柚皮素的线性相关程度良好(r2均大于0.99)。以质控样品计算该分析方法的批内精密度RSD在0.63％～11.57％范围内，批间精密度RSD在1.63％～11.07％范围内；方法的准确度在87.38％～116.75％之间；方法的提取回收率在69.62％～92.64％之间。各项稳定性考察符合SFDA要求。该分析方法经验证结果满意，样品处理及检测过程简单、快速，可满足柚皮素临床前药代动力学研究的要求。
二、柚皮素在离体大鼠肝脏灌流模型中的首过代谢研究
建立离体大鼠肝脏灌流模型并研究柚皮素在该模型的首过代谢。首先利用UP-100通用灌流仪建立了一过性离体大鼠肝脏灌流模型，在灌流时长9 0min内通过检测AST、ALT和LDH的浓度，观察肝脏外观及胆汁流量，测定肝重变化，进行组织切片观察来验证离体灌流肝脏的损伤程度。模型验证结果表明离体肝脏在本实验条件下能保持较好的组织结构和肝功能，可用于药物代谢研究。利用已建立的模型，分别以5、10、25、50 μM浓度的柚皮素进行离体肝灌流，收集入、出口灌流液、胆汁和灌流结束后的肝脏组织样品。在灌流液、胆汁及肝脏组织中均能检出原型柚皮素及其葡萄糖醛酸/硫酸结合型代谢产物。柚皮素的肝清除率为12.11±5.46 ml/min到16.76±1.29 ml/min。葡萄糖醛酸/硫酸结合型柚皮素的浓度及AUC随剂量不成比例地增长，25 μM组与50 gM组无差异，剂量回收率随着剂量的增加，从92.85％±9.40％下降到60.23％±12.40％。提示可能随着给药浓度的提高，柚皮素在Ⅱ相代谢酶的代谢趋于饱和，可能出现了一相代谢。此外对胆汁样品进行代谢产物结构分析表明，胆汁中主要的Ⅱ相代谢产物为单葡萄糖醛酸化柚皮素。
三、柚皮素在大鼠原代肝细胞中的首过代谢研究
通过大鼠原代肝细胞培养方法考察柚皮素在肝细胞中的代谢情况。MTI实验结果表明柚皮素浓度在100 μM以下对肝细胞无毒性。以5、10、25、50 μM的柚皮素进行代谢实验，在2小时内原型柚皮素在系统中的回收率分别为18.23％±1.34％，19.24％±1.42％，22.35％±1.59％及44.34％±2.50％，50 μM组显著高于其他三组。按照一级消除动力学对各浓度进行回归，5、10、25μM组的内在清除率基本相等，约为19.87 ml/min，而50μM组的线性回归差，表明柚皮素Ⅱ相代谢酶随着浓度的升高出现饱和的现象。
四、柚皮素在大鼠体内的肝脏首过代谢研究
通过比较门静脉给药与右颈总静脉给药两种给药方式下大鼠血浆中原型柚皮素与总柚皮素的各药动学参数，来考察柚皮素在大鼠体内的肝首过代谢。给药剂量为10 mg/kg，颈静脉给药组与门静脉给药组大鼠的原型柚皮素的药代参数除了KE、V与t1/2，其它参数C2min、AUC、CL等均在两个不同给药方式问存在显著差异，P<0.05。门静脉给药组的葡萄糖醛酸／硫酸结合型柚皮素的AUC为15500.38±5844.55 ng·h/ml，大于颈静脉给药组的11781.53±2101.82 ng·h/ml，但P>0.05，柚皮素在大鼠体内的肝脏首过代谢约为52.4％。
综上所述，柚皮素的肝脏首过代谢较强，大于50％，且主要代谢产物为葡萄糖醛酸／硫酸结合的Ⅱ相结合物，其代谢酶存在饱和性。