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目的：探讨局部应用不同浓度的甲氨蝶呤(MTX)诱导成纤维细胞凋亡及其预防膝关节术后瘢痕粘连的作用,并研究其可能机制。方法：将18只成年新西兰大兔平均三组,分别是2 mg/ml组、1 mg/ml组和生理盐水对照组。耳缘静脉注射质量百分比为2%的戊巴比妥钠麻醉后,备皮、消毒术区,打开膝关节后,用电钻在股骨内外侧髁制成约10mm×10mm的骨缺损区,将对应的不同浓度的MTX和生理盐水应用于骨缺损区,术后常规消毒和抗生素治疗3天,并用克氏针固定在完全屈曲的位置4周。4周后将兔子处理后,瘢痕组织制成标本,行HE染色和Masson染色观察MTX预防膝关节疤痕粘连的效果以及免疫组织化学法检测膝关节瘢痕中CHOP的表达量的变化。体外培养成纤维细胞,以不同浓度的MTX处理24h后,CCK-8检测成纤维细胞的活力变化,Hoechst33342染色法观察应用MTX处理对成纤维细胞凋亡的影响。Western-blot检测内质网应激和凋亡相关蛋白表达情况,如cleaved PARP、CHOP、Bcl-2、 Bax。结果：本实验中所有的动物未发生死亡、皮肤坏死、膝关节感染等现象,恢复情况良好。HE染色结果：2 mg/ml MTX组和1 mg/ml MTX组瘢痕中成纤维细胞数量小于对照组瘢痕组织中的数量(P<0.05),而2 mg/ml MTX组瘢痕中成纤维细胞数量也小于1 mg/ml MTX组瘢痕中数量,差异具有统计学意义(P<0.05)。Masson染色观察的结果：对照组兔膝关节内可见致密的瘢痕组织、大量的胶原和成纤维细胞沉积,而实验组中瘢痕组织明显减少,胶原含量明显降低,且2 mg/ml MTX组较1 mg/mlMTX组瘢痕组织及胶原含量更低,Image Pro Plus分析后可知胶原密度随着浓度的增加而逐渐降低,各组间的差别具有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学结果以Image Pro Plus分析后显示2 mg/ml MTX组瘢痕组织中CHOP的表达量明显高于1 mg/ml MTX组和对照组中CHOP的表达量(P<0.05)；而1 mg/mlMTX组瘢痕中CHOP的表达量明显高于对照组的中CHOP的表达量(P<0.05),表明CHOP表达随着浓度的增高而升高,内质网应激路径可能参与了MTX的作用过程。体外细胞实验显示MTX能有效抑制成纤维细胞的增殖和活力,呈现出明显的浓度依赖的趋势,Hoechst染色发现MTX处理组的凋亡细胞明显多于对照组。Western-blot结果显示MTX处理后的成纤维细胞随着时间延长,cleaved-PARP的表达量增高,同时CHOP、bax的表达量升高,而bcl-2的表达量降低,说明MTX可以抑制成纤维细胞活力,诱导成纤维细胞凋亡,而内质网应激途径参与其中。结论：MTX能通过内质网应激诱导成纤维细胞凋亡,预防兔膝关节瘢痕粘连。