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樟芝(Antrodia camphorata, Antrodia cinnamomea),又名牛樟芝、牛樟菇、樟内菇等,是我国台湾地区特有的一种珍稀药食用真菌,具有抗癌、保肝、抗炎、抗氧化、调节免疫力等多种生物活性。但野生樟芝子实体寄主专一,生长缓慢,较为稀缺,难以满足市场需求。深层发酵工艺由于生产周期短、批次稳定性好,是规模化生产樟芝及其活性成分的主要方式。然而,目前樟芝深层发酵工艺在大规模生产过程中仍然存在一些问题,如种子制备过程繁琐而耗时、生产周期能否进一步缩短、生产成本能否进一步降低、生产效率能否进一步提高等。本课题组首次报道了樟芝深层发酵后期在合适的环境和营养条件下能够大量产生无性孢子的现象,并发现将樟芝节孢子接入新鲜培养基中能够快速萌发并启动新一轮发酵。本文充分利用了樟芝在深层发酵后期会大量产生无性孢子以及形成的菌丝球与孢子容易分离的特性,建立了樟芝无性孢子介导的高效循环发酵工艺,缩短了生产周期、节约了生产成本、提高了生产效率。然而,在深层发酵后期及时产生大量的无性孢子是樟芝循环发酵工艺进行多批次稳定发酵生产应用的必要条件。因此,为了保障樟芝高效循环发酵工艺的持续性及批次稳定性,本文采用2DE、RNA-seq、RT-qPCR等技术手段,对不同发酵时期的樟芝菌丝体进行蛋白质组学及转录组学等相关分析,预测了樟芝深层发酵无性产孢过程的分子调控机制,并通过营养限制、Ca2+诱导等方式对该调控机制进行验证,为实现樟芝深层发酵无性产孢过程的稳定可控奠定了理论基础。本文主要结论如下:(1)建立了无性孢子介导的樟芝高效循环发酵工艺,缩短了生产周期,节约了生产成本,提高了生产效率。樟芝循环发酵工艺可稳定生产8个批次,持续高效生产2个月。与传统批次发酵相比,将8个批次的总生产时间由80 d缩短到58 d,将平均生产周期由10 d缩短到7 d。同时,胞内多糖批次生产力提高了 40.3%,总三萜批次生产力提高了 43.2%, AtrodinA批次生产力提高了 42.5%, AtrodinB批次生产力提高了 58.6%。(2)预测了樟芝深层发酵过程中FluG介导的无性产孢信号通路,为实现樟芝深层发酵无性产孢过程的稳定可控及保障樟芝高效循环发酵工艺的持续性和批次稳定性奠定了理论基础。采用2DE、RNA-seq、RT-qPCR等技术手段,对樟芝无性孢子及不同发酵时间的菌丝体进行了蛋白质组学和转录组学等相关分析,并结合相关文献信息预测了樟芝深层发酵过程中FluG介导的无性产孢信号通路。即,在无性产孢之前,SfgA蛋白通过结合在flbA、flbB、flbC等基因的启动子上,阻遏flbA、flbB、flbC等基因的表达;同时,FluG蛋白逐渐积累并参与合成胞外产孢诱导因子(Extracellular sporulation inducing factor,ESIF),当FluG蛋白积累到一定浓度或受产孢信号诱导时,便通过ESIF移除SfgA蛋白来激活flbA、flbB、flbC等基因;随后,FlbA通过抑制G蛋白介导的信号通路来促进产孢,而G蛋白介导的信号通路抑制产孢、促进生长;FlbB激活flbD基因后,与FlbD形成FlbB-FlbD异质二聚体,并与FlbC共同作用移除结合在brlA基因启动子上的阻遏蛋白NsdD而激活brlA基因;BrlA激活abaA基因,AbaA进一步激活wetA基因,而wetA基因直接导致无性产孢及促进孢子成熟;此外,AbaA可促进vosA和velB基因的表达,而VosA和VelB形成的VosA-VelB异质二聚体可促进孢子成熟并抑制brlA基因表达;同时,VeA抑制brlA基因表达,而StuA促进brlA基因表达。(3)分析了樟芝无性产孢过程对营养限制诱导的响应机制,验证了樟芝深层发酵过程中FluG介导的无性产孢信号通路。采用RNA-seq及RT-qPCR等技术手段,对不同营养条件下培养的樟芝菌丝体进行了转录组学等相关分析,并结合相关文献信息预测了营养限制诱导樟芝无性产孢的分子调控机制。即,当氮饥饿时,细胞中相应的传感器将信号传递给areA和tmpA等基因并促进其表达。其中,AreA直接或间接作用于flbD并促进其表达,进而促进brlA表达,而TmpA直接或间接作用于brlA并促进其表达;当碳饥饿时,转运蛋白Rco-3作为葡萄糖传感器将信号直接或间接传递给brlA并促进其表达;BrlA促进abaA基因的表达,AbaA进一步促进wetA基因的表达,而wetA基因直接导致无性产孢及促进孢子成熟;此外,当营养(碳或氮)饥饿时,相应的传感器将信号直接或间接传递给gulC和chsD等基因并促进其表达,协助孢子细胞壁组分的合成,促进孢子成熟。同时,gulC还能促进细胞自溶,为产孢过程提供能量及合成原料。(4)分析了樟芝无性产孢过程对Ca2+诱导的响应机制,进一步验证了樟芝深层发酵过程中FluG介导的无性产孢信号通路。采用2DE及RT-qPCR等技术手段,分析了添加不同浓度Ca2+培养的樟芝菌丝体的差异表达蛋白,预测了 Ca2+/钙调素和FluG介导的樟芝无性产孢信号通路。即,环境中的Ca2+通过钙通道蛋白(Cch1和Mid1)进入细胞质与钙调蛋白(CaM)结合形成Ca2+-CaM复合体并激活钙调磷酸酶,同时热休克蛋白大量合成。crz1基因被钙调磷酸酶激活后,其编码的转录因子Crz1直接作用于abaA基因并促进其表达;钙调磷酸酶或HSP90直接或间接地促进产孢上游调控途径中的flbA、flbB和flbC基因表达,进而促进brlA基因表达或抑制G蛋白介导的信号通路,最终达到促进产孢的效果;HSP90和WetA参与细胞壁组分的合成,都能促进孢子成熟。