论文部分内容阅读
体细胞克隆技术为创制抗病、产品品质提升、节粮和环保等目标性状改良的转基因猪育种新材料提供了可能，也有助于拓展以猪为模型，开展人类相关疾病研究，尤其是与转基因、干细胞等生物技术结合，有望建立猪源生物反应器以生产药物蛋白、为人类器官移植开辟异源供体以及生物学机理研究等提供革命性的手段。目前克隆效率依然低下，其最根本原因是表观重编程不彻底。表观遗传修饰主要包括DNA甲基化/去甲基化、组蛋白修饰（如乙酰化/去乙酰化、甲基化/去甲基化、SUMO化、磷酸化等）等。其中组蛋白是染色体上核小体的核心，其物理学和化学修饰的变化都会影响相应区域的基因表达，从而参与调控真核细胞的生长和发育，但目前对组蛋白修饰，尤其是乙酰化修饰是否参与猪胚胎着床前期发育的研究极少。故本研究拟以H3K27ac为对象，检测H3K27ac在体外受精胚（In vitro fertilization embyo，IVFE）、体细胞克隆胚（Nuclear transfer embryo，NTE）以及孤雌激活胚（Parthenogenetic activationembryo，PAE）等不同类型猪着床前胚胎不同发育阶段的表达量，进而揭示同一类型胚胎整个着床前发育阶段的动态变化规律，通过比较不同类型胚胎的变化趋势，关联胚胎发育命运，为揭示H3K27ac在猪NTE早期发育期间的作用机制奠定基础。试验一：旨在揭示猪胚胎着床前发育期间H3K27ac的动态变化谱。首先，对H3K27ac抗体特异性进行了检测。用竞争性免疫多肽在猪孤雌囊胚上做验证，结果显示没有H3K27ac信号，表明本文所用抗体H3K27ac是特异性的。我们检测了H3K27ac在NTE和PAE激活后第15min、30min和1h的表达，根据NTE的H3K27ac水平，追踪这一修饰的源头；进而以IVFE为参照，重点分析了猪NTE在2hpa、6hpa、12hpa、14hpa、16hpa、1cell、2cell、4cell、8cell、morula、EB、EXPB和HB时期的H3K27ac表达水平。结果如下：MII期卵母细胞H3K27ac呈低水平，并一直持续到卵母细胞孤雌激活后30min，直到1h后H3K27ac水平才有升高的趋势。核移植供体细胞H3K27ac水平很高，同第15min、30min、1h的NTE的H3K27ac水平相当。在NTE2hpa、6hpa、12hpa、14hpa H3K27ac表达水平很高，16hpa开始减弱，4cell、8cell降至最低，morula时H3K27ac荧光信号有增强趋势，直到blastocyst增至最强，这与PAE和IVFE的H3K27ac表达模式相同，不同的是，NTE HB的H3K27ac水平减弱，同PAE HB，而IVFE HB依然维持稳定高水平H3K27ac。结果表明，NTE的H3K27ac这一修饰来源于供体细胞，并且4cell、8cell阶段H3K27ac的去除可能更有利于胚胎基因组激活。试验二：目的是探讨猪胚胎基因组激活前H3K27ac表达逐渐降低是否依赖于DNA复制、RNA转录和蛋白质合成。首先，将孤雌激活后6h的卵母细胞分别经3μg.mL-1阿非迪霉素处理12h、25μg.mL-1鹅膏覃碱处理24h、50μg.mL-1放线菌酮处理24h后，再解除抑制，各自在新鲜PZM-3继续培养24h、12h、12h，设置对照。结果发现：三个处理组同对照组相比，H3K27ac水平相当且很低，而孤雌激活后6h的卵母细胞H3K27ac水平很高。表明，H3K27ac去除是一个主动的过程。试验三：为探索H3K27ac乙酰化酶与去乙酰化酶的动态变化规律，我们收集了GV期和MII期卵母细胞各20枚，IVFE、NTE和PAE的1cell、2cell、4cell和blastocyst胚胎各20枚。定量结果显示：IVFE在1cell、2cell、4cell和blastocyst的HACD1、HACD2、CBP和MBD3要比NTE和PAE同时期胚胎相应基因表达量高。其中，NTE中HACD2表达较高，且在4cell时期NTE的HACD2高于1cell、2cell和blastocyst的NTE的相应基因的表达量。结果表明，这种时空表达差异可以为更多的转录翻译合成组蛋白去乙酰化酶，使4cell、8cell时期H3K27ac能够有效去除，似乎更利于胚胎基因组激活。试验四：旨在研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对猪克隆胚胎早期发育的作用及分子机制。将重构胚经50nM TSA处理24h后，去除TSA，PZM-3继续培养，设置对照，2d、7d后分别观察并记录胚胎卵裂与囊胚发育情况并收集囊胚，免疫荧光。结果：TSA处理组明显提高了囊胚率（42.5%±2.8%vs.16.0%±3.7%）和总细胞数（77.4±4.9vs.54.0±7.6），且其处理组囊胚H3K27ac水平比对照组更接近体外受精的水平。表明：TSA能提高克隆囊胚的发育效率，并改善克隆囊胚H3K27ac水平。综上所述，本研究首次揭示了组蛋白H3K27ac修饰在猪早期胚胎全基因组表达模式，发现这种表达模式因猪早期胚胎类型不同而有所差异，且猪胚胎基因组激活前H3K27ac的去除是一个主动的过程，这种主动的去除机制可能更利于胚胎基因组激活。H3K27ac不仅参与了调控猪早期胚胎的发育，而且其时空表达对NTE的发育命运具有一定影响，这为猪NTE表观重编程研究提供了理论依据并奠定了坚实的基础。