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目的:
肺癌是全球发病率高居第二位、死亡率位居第一的恶性肿瘤。肺癌主要包括非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，其中NSCLC的发病率约占肺癌发病率的85％，为肺癌的主要类型。非小细胞肺癌起病十分隐匿，多数到中晚期才被发现确诊，5年生存率较低。临床上诊断非小细胞肺癌的早期手段非常有限，存在诸如患者依从性差、低敏感性、低特异性等缺点，发现时已为晚期，导致错过最佳治疗时机，且晚期手术难度增加，复发率极高。因此，寻找针对非小细胞肺癌快速无侵入性、高特异度、高敏感度的新型肿瘤标志物是重中之重。近年来非小细胞肺癌患者外泌体中各种微小RNA(micro RNA，miRNA)的异常表达，成为研究的热点。有越来越多的研究证实外泌体包裹的miRNA在肿瘤的发生发展和转移中起到了关键作用，可作为潜在的新型非侵入性生物标志物，用于肿瘤的诊断。本研究旨在探讨血清外泌体来自三个同源的基因簇编码的miRNA分子在非小细胞肺癌患者中的相对表达情况，评估其对非小细胞肺癌的临床诊断价值，为非小细胞肺癌的诊断提供更有价值的新的生物标志物。
方法:
1.以“NSCLC、miRNA”为主题词，从PubMed数据库检索相关文献，查找到在非小细胞肺癌患者中呈差异表达的miRNAs分子，作为待研究的miRNA分子。
2.使用ExoQuickTMsolution试剂盒利用沉淀法从非小细胞肺癌患者和健康对照者血清中分离提取外泌体，并通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析技术和外泌体标记蛋白TSG101和CD9免疫印迹技术鉴定外泌体。
3.筛选阶段，随机将48例非小细胞肺癌患者和48例健康对照者纳入训练集，通过qRT-PCR检测血清外泌体中候选miRNAs的相对表达量，经统计学分析筛选出在两组中具有显著表达差异的miRNAs，绘制受试者工作曲线(ROC)，计算曲线下面积(AUC)。
4.验证阶段，再随机选取131例非小细胞肺癌患者和96例健康对照者纳入验证集。进一步验证训练集中筛选出的呈差异表达的miRNA在验证集中的相对表达情况，并评价其诊断效能。
5.将筛选出的血清外泌体miRNA分子，结合目前临床开展的非小细胞肺癌相关蛋白肿瘤标志物，包括鳞状细胞癌抗原(SCCA)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)和癌胚抗原(CEA)，通过Logistic多元回归分析，建立非小细胞肺癌血清外泌体miRNA诊断模型，通过ROC曲线下面积评估该模型的诊断效能及与非小细胞肺癌TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的关系。
6.分别统计分析训练集和验证集中血清外泌体hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20b-5p的相对表达量与非小细胞肺癌患者临床病理特征之间的相关性。
结果:
1.通过检索PubMed数据库，文献报道来自同源的三个miRNA基因簇，包括miR-17-92、miR-106a-363、miR-106b-25家族编码的共15个miRNAs，因其在非小细胞肺癌患者的支气管肺泡灌洗液中高表达，所以将其作为候选分子。
2.从非小细胞肺癌患者和健康对照者血清中分离提取外泌体，NTA技术检测到99.5％颗粒直径分布于30～200nm范围，免疫印迹技术检测到外泌体表达蛋白CD9和TSG101，并通过透射电子显微镜观察到完整外泌体形态。
3.筛选阶段，15个候选miRNAs分子中有hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20b-5p共2个miRNA分子在非小细胞肺癌和健康对照血清中呈差异表达。训练集血清外泌体hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20b-5p在非小细胞肺癌患者中均呈高表达(均P＜0.0001)，受试者工作曲线下面积(AUC)分别为0.834和0.808。
4.验证阶段，相对健康对照者，血清外泌体hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20b-5p在验证集非小细胞肺癌患者中同样也呈高表达(均P＜0.0001)，AUC分别为0.784和0.756。
5.建立非小细胞肺癌诊断模型。该模型对训练集中非小细胞肺癌的AUC为0.914(95％CI=0.839-0.961)，敏感度为91.6‰特异度为83.3％。对验证集中非小细胞肺癌的AUC为0.824(95％CI=0.768-0.871)，敏感度为72.5％，特异度为72.9％，其对非小细胞肺癌患者TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的诊断AUC分别为0.783、0.832和0.902。
6.验证集中，hsa-miR-17-5p与非小细胞肺癌患者肿瘤大小、组织学类型和TNM不同分期有显著的统计学相关性(P＜0.05)，hsa-miR-20b-5p与有无淋巴结转移有显著统计学相关性(P＜0.05)。
结论:
1.血清外泌体hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20b-5p两个分子在非小细胞肺癌患者中呈显著高表达，对非小细胞肺癌具有较高的临床诊断价值。
2.基于Logistic回归分析构建的血清外泌体模型对NSCLC具有较高的诊断效能，其与病理分期有重要的关系，对诊断非小细胞肺癌具有重要意义。
肺癌是全球发病率高居第二位、死亡率位居第一的恶性肿瘤。肺癌主要包括非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，其中NSCLC的发病率约占肺癌发病率的85％，为肺癌的主要类型。非小细胞肺癌起病十分隐匿，多数到中晚期才被发现确诊，5年生存率较低。临床上诊断非小细胞肺癌的早期手段非常有限，存在诸如患者依从性差、低敏感性、低特异性等缺点，发现时已为晚期，导致错过最佳治疗时机，且晚期手术难度增加，复发率极高。因此，寻找针对非小细胞肺癌快速无侵入性、高特异度、高敏感度的新型肿瘤标志物是重中之重。近年来非小细胞肺癌患者外泌体中各种微小RNA(micro RNA，miRNA)的异常表达，成为研究的热点。有越来越多的研究证实外泌体包裹的miRNA在肿瘤的发生发展和转移中起到了关键作用，可作为潜在的新型非侵入性生物标志物，用于肿瘤的诊断。本研究旨在探讨血清外泌体来自三个同源的基因簇编码的miRNA分子在非小细胞肺癌患者中的相对表达情况，评估其对非小细胞肺癌的临床诊断价值，为非小细胞肺癌的诊断提供更有价值的新的生物标志物。
方法:
1.以“NSCLC、miRNA”为主题词，从PubMed数据库检索相关文献，查找到在非小细胞肺癌患者中呈差异表达的miRNAs分子，作为待研究的miRNA分子。
2.使用ExoQuickTMsolution试剂盒利用沉淀法从非小细胞肺癌患者和健康对照者血清中分离提取外泌体，并通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析技术和外泌体标记蛋白TSG101和CD9免疫印迹技术鉴定外泌体。
3.筛选阶段，随机将48例非小细胞肺癌患者和48例健康对照者纳入训练集，通过qRT-PCR检测血清外泌体中候选miRNAs的相对表达量，经统计学分析筛选出在两组中具有显著表达差异的miRNAs，绘制受试者工作曲线(ROC)，计算曲线下面积(AUC)。
4.验证阶段，再随机选取131例非小细胞肺癌患者和96例健康对照者纳入验证集。进一步验证训练集中筛选出的呈差异表达的miRNA在验证集中的相对表达情况，并评价其诊断效能。
5.将筛选出的血清外泌体miRNA分子，结合目前临床开展的非小细胞肺癌相关蛋白肿瘤标志物，包括鳞状细胞癌抗原(SCCA)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)和癌胚抗原(CEA)，通过Logistic多元回归分析，建立非小细胞肺癌血清外泌体miRNA诊断模型，通过ROC曲线下面积评估该模型的诊断效能及与非小细胞肺癌TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的关系。
6.分别统计分析训练集和验证集中血清外泌体hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20b-5p的相对表达量与非小细胞肺癌患者临床病理特征之间的相关性。
结果:
1.通过检索PubMed数据库，文献报道来自同源的三个miRNA基因簇，包括miR-17-92、miR-106a-363、miR-106b-25家族编码的共15个miRNAs，因其在非小细胞肺癌患者的支气管肺泡灌洗液中高表达，所以将其作为候选分子。
2.从非小细胞肺癌患者和健康对照者血清中分离提取外泌体，NTA技术检测到99.5％颗粒直径分布于30～200nm范围，免疫印迹技术检测到外泌体表达蛋白CD9和TSG101，并通过透射电子显微镜观察到完整外泌体形态。
3.筛选阶段，15个候选miRNAs分子中有hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20b-5p共2个miRNA分子在非小细胞肺癌和健康对照血清中呈差异表达。训练集血清外泌体hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20b-5p在非小细胞肺癌患者中均呈高表达(均P＜0.0001)，受试者工作曲线下面积(AUC)分别为0.834和0.808。
4.验证阶段，相对健康对照者，血清外泌体hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20b-5p在验证集非小细胞肺癌患者中同样也呈高表达(均P＜0.0001)，AUC分别为0.784和0.756。
5.建立非小细胞肺癌诊断模型。该模型对训练集中非小细胞肺癌的AUC为0.914(95％CI=0.839-0.961)，敏感度为91.6‰特异度为83.3％。对验证集中非小细胞肺癌的AUC为0.824(95％CI=0.768-0.871)，敏感度为72.5％，特异度为72.9％，其对非小细胞肺癌患者TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的诊断AUC分别为0.783、0.832和0.902。
6.验证集中，hsa-miR-17-5p与非小细胞肺癌患者肿瘤大小、组织学类型和TNM不同分期有显著的统计学相关性(P＜0.05)，hsa-miR-20b-5p与有无淋巴结转移有显著统计学相关性(P＜0.05)。
结论:
1.血清外泌体hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20b-5p两个分子在非小细胞肺癌患者中呈显著高表达，对非小细胞肺癌具有较高的临床诊断价值。
2.基于Logistic回归分析构建的血清外泌体模型对NSCLC具有较高的诊断效能，其与病理分期有重要的关系，对诊断非小细胞肺癌具有重要意义。