水稻OsAAD1蛋白调控叶绿体发育及植株生长的机理研究

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水稻(Oryza Sativa),是全世界范围的一种重要的粮食作物,确保其高产稳产是解决我国以及世界许多其它国家粮食问题的关键,是我国可持续发展的坚强保障。水稻株型和光合效率是影响其产量的主要因素,然而,影响这些农艺性状的分子机理,目前还不十分清楚。  本研究利用水稻野生型品种蜀恢527经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变获得的矮秆淡黄叶突变体actinarraydefecting I(aad1)为材料,开展性状鉴定、基因克隆以及功能分析等研究,研究结果如下:  1. aad1突变体在植株生长初期表现为植株矮小,叶片淡黄色,后期叶色逐步恢复成野生型水平,经叶绿素含量测定及叶绿体超微结构观察并与野生型比较后发现,aad1突变体在生长初期叶绿素含量减少、叶绿体降解趋势加剧,后期差异逐渐减少。考察田间种植条件下的农艺性状发现,aad1突变体结实差,且种子大小和饱满度均明显差于野生型。  2.通过对野生型和突变体aad1根部和花粉粒中微丝的染色实验表明,在突变体aad1中,微丝排列都异于野生型。K2-KI染花粉粒实验证明,突变体aad1的花粉粒育性极差。  3.以突变体aad1为母本,Nip为父本进行杂交配组构建F2群体并通过图位克隆将基因定位于水稻8号染色体74.3kb区域内;预测候选基因并通过测序后初步认为该区域内编码Formin蛋白的OsAAD1为目的基因,该基因全长2649bp,包含4个外显子,突变为其编码区第610位碱基由C突变为T,导致翻译过程中脯氨酸(Pro)被丝氨酸(Ser)替代。  4.应用生物信息学软件分析发现OsAAD1基因预测编码一个由883个氨基酸组成的Formin蛋白,具有保守的FH1和FH2结构域,该蛋白糖基化、磷酸化等修饰位点较多,具有跨膜区段,可能是一个定位于细胞质膜的跨膜蛋白,且与其在短柄草以及玉米中的同源蛋白亲缘关系较近。  5.通过Real-time qPCR的方法检测OsAAD1基因在水稻中的表达模式,结果显示OSAAD1基因在叶片和叶鞘中表达水平较高,在aad1突变体中,根部的表达水平显著高于野生型。亚细胞定位表明,OsAAD1定位于质膜。  6.通过对酵母温敏突变体Y-double的互补实验,结果显示OsAAD1蛋白能够恢复酵母Y-double菌株对高温的敏感性。  7.通过将OsAAD1基因构建入pGEX-6P-1载体,转化BL21(DE3)诱导表达菌株,诱导表达OsAAD1蛋白,用于后续微丝微管排列实验。  8.通过植株根部IAA含量的测定以及根的重力反应实验探究OsAAD1蛋白是否参与激素调控途径。  9.通过建立双荧光素酶实验系统,对目的基因的表达调控进行了相关探究。
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