论文部分内容阅读
1、背景缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)是指缺血期处于可逆损伤的组织细胞经恢复血液再灌注后,损伤加重或转化为不可逆性损伤。随着临床心脏外科体外循环手术及冠脉内溶栓、经皮穿刺冠状动脉腔内介入治疗(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)的广泛开展,心肌IRI已成为一个普遍的临床问题,愈来愈引起心脏专科医生的重视。IRI是一个涉及多种机制的复杂病理生理过程,一般认为主要有以下几种作用机制：1.自由基反应；2.细胞内钙超载；3.白细胞积聚；4.高能磷酸化合物缺乏；5.无复流现象等等。1986年Murry等发现狗心脏多次短暂的缺血可以减轻随后较长时间的缺血再灌注带来的心肌损伤,由此提出缺血预处理(ischemic preconditioning, IPC)的概念,认为心肌IPC可以提高心肌细胞自身抗损伤的耐受性或适应性,减轻心肌IRI。后来大量的实验研究也印证了心肌IPC可以起到明确的心肌保护作用。但由于这种预处理需要在发生缺血前进行,使其临床应用价值大大受限。尽管心肌保护已经发展了多年,但现有的心肌保护措施大部分都属于针对择期心脏手术的预防性保护,而心脏专科的特点就是起病的突然性和严重性(如急性心肌梗死或急诊心脏手术),对于此类病人,发病时其心脏功能往往已经很差,而手术治疗不可避免的会产生心肌IRI,导致其心脏功能进一步恶化,所以心肌保护的意义显得尤为重要,但面对这样的情况大部分传统的心肌保护措施因为失去了应用的时机而显得作用有限。针对已缺血心肌,如何设法减轻再灌注损伤,成为心肌保护研究的一个难点。2003年Zhao等发现心肌缺血后在再灌注前进行短暂的心肌缺血再灌注也能对抗随后的心肌IRI,并能起到和IPC同样的心肌保护效果,于是提出了缺血后处理(ischemic postconditioning, IP)的概念,为IRI的防治提供了一个新的思路及方向。后处理作用机制涉及活性氧(reactive oxygen species, ROS)、内源性自身激活物、线粒体ATP敏感性钾通道、一氧化氮、再灌注损伤补救激酶途径(reperfusion injury salvage kinases, RISK)、线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)等多方面作用。研究发现对已缺血的心肌于再灌注开始时给予适量药物,可产生类似于后处理的心肌保护作用,即药物模拟后处理。而药物模拟后处理的可操作性明显强于常规意义上的IP,因此具有更为广泛的应用前景。已有学者将其应用于临床,并取得了较好的心肌保护效果。但目前文献报道用于模拟后处理的药物并不多,主要有腺苷、阿片类物质、挥发性麻醉药物等,且由于药物本身的副作用(如阿片类物质)或药物本身的特点(如挥发性麻醉药物),使其临床应用受到了较大的限制；而腺苷只是从改善心肌细胞能量代谢方面发挥一定的作用,作用途径较单一。寻找更加安全有效、便于临床应用的IP药物,无疑具有重要的临床实用价值。ω-3脂肪酸属于多不饱和脂肪酸,主要包括a-亚麻酸、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)等。近年来,ω-3脂肪酸的心脏保护作用引起了越来越多的重视。大规模的临床试验证明每日摄入500mg到1000mg的多不饱和脂肪酸可显著的减少心血管事件的发生几率。研究表明,ω-3脂肪酸具有免疫调节功能、抑制炎症反应、抗心律失常及抗血栓的作用。众所周知,心脏手术体外循环过程中血液直接接触异物表面、手术创伤,器官缺血再灌注导致白细胞与内皮细胞激活、体温变化、肠道内毒素释放等均可引发全身炎症反应综合征,炎性细胞因子、补体、中性粒细胞相继被激活,造成术后心功能受损,全身重要器官功能不良。因此,ω-3脂肪酸可以通过抑制全身及局部的炎症反应达到保护心脏功能的作用。进一步的研究发现ω-3脂肪酸还可通过作用于心肌细胞的离子通道、离子泵、交换体及影响细胞膜的稳定、氧化应激等发挥其心肌保护的作用。ω-3脂肪酸以游离脂肪酸形式直接溶于细胞浆膜磷脂易感应的疏水性内侧面,可降低细胞膜电兴奋性,一定程度上起到细胞膜电稳定的作用；同时心肌细胞膜磷脂的ω-3脂肪酸含量增加,使ω-6脂肪酸含量相对减少,能增加膜稳定性,并影响心肌细胞的各种离子通道、交换体等,最终减轻心肌IRI。亦有研究报道ω-3脂肪酸可以减少心肌耗氧量,减少心肌缺血再灌注时氧化应激及K+的丢失,从而减少再灌注性心律失常。在临床观察中发现,ω-3脂肪酸可增加血浆氧化脂质复合物和超活性氧化物的浓度,其中包括自由基和过氧化物酶等,有学者认为这相当于激活了人体的生存信号传导通路而达到了IPC的效果,从而效地减轻了发生心肌梗死或体外循环时缺血再灌注对心肌细胞的损伤。研究还发现ω-3脂肪酸可以调节新生鼠心肌细胞的相关下游基因表达从而调节炎症反应、细胞基质的重构、钙离子的释放和超活性氧化反应物的生成,这可能是ω-3脂肪酸发生心肌保护作用的重要机制。Me Guinness等在新西兰白兔心肌缺血再灌注模型中发现,ω-3脂肪酸预处理还可以诱导心肌细胞热休克蛋白(heat shock protein, HSP)的大量表达,降低了心肌梗死面积。但目前对ω-3脂肪酸的研究大部分都还是集中在其预处理对心肌的保护作用。联系到心肌IRI的几种发病机制,我们看到,ω-3脂肪酸在这几个方面都可能发挥作用,减轻心肌IRI,有希望作为一种安全有效的IP药物应用于临床心肌IRI的防治。2、目的利用离体大鼠心脏缺血再灌注模型,研究ω-3脂肪酸后处理是否能提高离体大鼠心脏缺血再灌注期间的抗氧化能力,并通过对心肌细胞梗死面积及线粒体超微结构损害程度的比较来判断ω-3脂肪酸后处理是否能产生有效的心肌保护作用,探讨其可能的作用机制,为寻找一种可安全有效地应用于临床心肌IRI防治的药物提供理论及实验依据。3、材料与方法3.1建立Langendorff离体大鼠心脏缺血再灌注模型3.2实验动物分组：SPF级雄性SD大鼠60只,随机分为4组,每组15只3.2.1持续灌注组(A组)：持续灌注150min；3.2.2缺血再灌注组(B组)：灌注30min,缺血30min后再灌注90min；3.2.3缺血后处理组(C组)：灌注30min,缺血30min后再灌注90min,在再灌注开始前进行4个循环复灌20s/缺血20s：3.2.4ω-3脂肪酸后处理组(D组)：灌注30min,缺血30min后再灌注90min,在再灌注开始前用ω-3脂肪酸的静脉制剂ω-3鱼油脂肪乳灌注15min,ω-3鱼油脂肪乳的终浓度为1：400(v/V)。3.3观察指标及方法3.3.1每组各取5只大鼠取左心室游离壁心肌组织检测灌流结束后心肌细胞氧化损伤和抗氧化指标：考马斯亮兰法测蛋白含量,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)采用黄嘌呤氧化酶法测定,丙二醛(malondialdehyde, MDA)采用硫代巴比妥酸法测定,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)采用可见光分光光度计法测定；3.3.2每组各取5只大鼠将心脏由心尖部向心底部切成lmm厚的薄片,TTC染色后存活心肌呈砖红色,梗死区不着色呈灰白色,置于玻片上,拍照后以ImageJ1.37软件计算心肌梗死面积百分比；3.3.3灌流结束后每组各取5只大鼠心脏心尖部组织进行处理并利用电子显微镜观察心肌细胞线粒体超微结构的形态及损伤程度。4、结果4.1与A组比较,心肌缺血再灌注后B、C、D组大鼠心肌细胞的LDH及MDA升高(P<0.05),SOD降低(P<0.05)。与B组比较,C组的SOD虽然有所升高,MDA有所降低,但与B组组间比较差异无统计学意义(P=0.165、P=0.056)；而与B组比较,D组的SOD升高及MDA、LDH降低均有统计学意义(P=0.049、P=0.049、P=0.000)。4.2各组心肌梗死面积百分比为：A组(11.14±3.09)%,B组(34.15±3.06)%,C组(26.94±2.73)%,D组(23.28±2.60)%。与B组比较,A组、C组及D组减少大鼠心肌梗死面积结果有统计学意义(P=0.000,P=0.007,P=0.000),C组与D组组间比较无明显差异性(P=0.368)。4.3将不同处理组的大鼠心肌组织置于透射电镜下放大11500倍观察,可见A组大鼠心肌线粒体体积基本正常,包膜完整,嵴排列整齐、连续,基质密度正常,肌纤维无明显水肿、断裂；B组心肌细胞线粒体大量肿胀变形,嵴数量明显减少,断裂、溶解成空泡状,线粒体基质电子密度降低,部分线粒体基质浓缩,电子密度加深而线粒体体积变小,肌纤维断裂、溶解；C组线粒体结构和B组相比病变有所改善,但仍有部分线粒体肿胀变形,嵴断裂,部分线粒体内有空泡形成；D组的损伤进一步减轻,大部分线粒体正常,仅见个别线粒体轻度肿胀、嵴数量减少,无明显断裂、溶解。5、结论ω-3脂肪酸后处理可有效提高离体大鼠心脏缺血再灌注后心肌组织SOD的水平,改善心肌抗氧化能力,减轻心肌细胞线粒体损伤,显著减少心肌梗死面积,从而起到减轻心肌IRI的作用。