论文部分内容阅读
目的初步建立肺炎克雷伯菌小鼠肺炎感染模型,并采用该模型评估不同类型的短链脂肪酸对小鼠的保护作用,为短链脂肪酸治疗肺炎克雷伯菌肺炎奠定理论基础;探讨短链脂肪酸对肺炎克雷伯菌的体外抗菌活性;从吞噬能力和分泌炎症因子的角度探讨短链脂肪酸对巨噬细胞在肺炎克雷伯菌感染中的作用从机制上进一步探究巨噬细胞上短链脂肪酸受体GPR43在肺炎克雷伯菌肺炎中起到的作用。材料与方法菌株来源肺炎克雷伯菌标准株ATCC 43816,由安徽省细菌耐药监控中心保存。方法1. 将小鼠分为4组,每组6-8只,分别喂养无菌水（阴性对照）,乙酸钠（150m M）,丙酸钠（150m M）,丁酸钠（150m M）5天,鼻滴法感染肺炎克雷伯菌12小时后,分别取出小鼠的左肺和右肺,左肺放入福尔马林中做病理切片,取右肺上叶研磨涂板,放入37℃培养箱16-18小时后,记录细菌菌落的数量。取右肺中叶和下叶研磨,用流式细胞仪检测肺组织中炎症因子的量。通过鼻滴法感染短链脂肪酸预处理5天和未处理的小鼠,在7天内实时记录每组存活小鼠数量,并绘制小鼠的生存曲线。2.将肺炎克雷伯菌置于不同浓度的短链脂肪酸中,观察细菌的生长速率是否发生变化。在体外用不同浓度的短链脂肪酸提前孵育RAW 264.7细胞12个小时,以细菌:细胞（100:1）的比例向细胞中加入CFSE标记的肺炎克雷伯菌,3小时后收集细胞,通过流式细胞仪检测不同短链脂肪酸处理细胞的平均荧光强度,观察其吞能细菌噬力的变化;收集150m M SCFAs处理五天的小鼠肺泡巨噬细胞,在DMEM培养基中贴壁培养,分离肺泡巨噬细胞,以同样的方法检测其吞噬能力的变化。将不同浓度的短链脂肪酸与肺炎克雷伯菌共同刺激RAW 264.7,细菌与细胞的比例为10:1,感染6小时后收集6孔板中的巨噬细胞,提取细胞的RNA,通过实时荧光定量PCR检测炎症因子IL-6,TNF-α和MCP-1的表达水平。3.检测在不同浓度的短链脂肪酸的刺激下肺泡巨噬细胞上GPR43受体表达量的变化以及肺炎克雷伯菌与短链脂肪酸共刺激下巨噬细胞上GPR43受体的表达量。通过CRISPR/Cas9技术对巨噬细胞的gpr43基因敲除,获得gpr43-/-细胞,以细菌:细胞（100:1）的比例向gpr43-/-细胞中加入CFSE标记的肺炎克雷伯菌,观察其对细菌吞噬能力的变化,乙酸钠,丙酸钠,丁酸钠孵育gpr43-/-细胞,观察其对细菌吞噬能力。肺炎克雷伯菌以10:1（细菌:细胞）的比例加入gpr43基因敲除细胞中,6小时后收集细胞,提取细胞RNA,检测炎症因子IL-6,TNF-α和MCP-1m RNA表达量。结果1.经150m M乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠预处理的小鼠与口服无菌水的小鼠相比,在感染肺炎克雷伯菌后,小鼠的生存曲线有差异;肺炎克雷伯菌感染12小时后,乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠预处理的小鼠肺组织中的细菌计数下降,细胞因子IL-6,MCP-1和TNF-α降低,肺组织学评分明显降低。2. 乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠和PBS中肺炎克雷伯菌的生长曲线无差异;与未处理的RAW 264.7细胞相比,乙酸钠,丙酸钠,丁酸钠预处理的RAW 264.7细胞感染CFSE标记的肺炎克雷伯菌后平均荧光强度增强;与口服无菌水的小鼠相比,口服乙酸钠,丙酸钠,丁酸钠的小鼠体内的肺泡巨噬细胞感染CFSE标记的肺炎克雷伯菌后平均荧光强度增强;与肺炎克雷伯菌单独刺激的RAW264.7细胞相比,乙酸钠,丙酸钠,丁酸钠与肺炎克雷伯菌共同刺激的RAW264.7细胞炎症因子IL-6,MCP-1和TNF-αm RNA的表达增高。3. 乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠孵育的RAW 264.7细胞上GPR43 m RNA的表达增强;肺炎克雷伯菌与乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠共同刺激RAW 264.7细胞,GPR43m RNA的表达明显增高;与野生型RAW 264.7细胞相比,CFSE标记的肺炎克雷伯菌感染gpr43-/-细胞后,平均荧光强度降低;与野生型RAW 264.7细胞相比,gpr43-/-细胞在受到肺炎克雷伯菌刺激后,炎症因子IL-6,MCP-1和TNF-αm RNA表达降低;与肺炎克雷伯菌单独刺激相比,gpr43-/-细胞在受到乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠与肺炎克雷伯菌共同刺激后,炎症因子IL-6,MCP-1和TNF-αm RNA表达无明显变化。讨论1.口服SCFAs（乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠）降低肺炎克雷伯菌肺部感染小鼠的肺组织中的细菌计数,细胞因子IL-6,MCP-1和TNF-α;口服乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠降低感染小鼠的肺组织学评分,降低其死亡率。SCFAs对肺炎克雷伯菌感染的小鼠具有保护作用。2.在体外SCFAs无法对肺炎克雷伯菌的生长造成影响,SCFAs可以增强RAW264.7细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力;口服SCFAs可以增强体内肺泡巨噬细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力;SCFAs可以增强肺炎克雷伯菌感染的巨噬细胞中炎症因子IL-6,MCP-1和TNF-αm RNA的表达。3. SCFAs可以增强RAW 264.7细胞上GPR43的表达;肺炎克雷伯菌与SCFAs共同刺激RAW 264.7细胞,GPR43的表达明显增高;gpr43-/-细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力降低,gpr43基因敲除后,SCFAs增强巨噬细胞吞噬能力的作用消失了;gpr43基因对炎症因子IL-6,MCP-1和TNF-αm RNA的表达起着调控作用;gpr43基因对SCFAs增强肺炎克雷伯菌感染的巨噬细胞炎症因子IL-6,MCP-1和TNF-αm RNA的表达起着关键作用。