【摘 要】
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目的:从DJ-1与线粒体复合体Ⅰ的两个亚基ND1和NDUFA4蛋白相互作用的角度,在细胞水平探讨DJ-1介导缺氧预适应（HPC）保护缺氧/复氧（H/R）心肌细胞线粒体复合体Ⅰ酶活性,对抗H/R诱发的氧化应激,产生心肌细胞延迟保护的分子机制。方法:1.H9c2心肌细胞经DJ-1-siRNA瞬时转染培养24 h后建立HPC模型,或经pFLAG-DJ-1重组质粒转染,24 h后进行H/R处理;H/R后,
【基金项目】
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国家自然科学基金（NO:81460060,81060022）
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目的:从DJ-1与线粒体复合体Ⅰ的两个亚基ND1和NDUFA4蛋白相互作用的角度,在细胞水平探讨DJ-1介导缺氧预适应（HPC）保护缺氧/复氧（H/R）心肌细胞线粒体复合体Ⅰ酶活性,对抗H/R诱发的氧化应激,产生心肌细胞延迟保护的分子机制。方法:1.H9c2心肌细胞经DJ-1-siRNA瞬时转染培养24 h后建立HPC模型,或经pFLAG-DJ-1重组质粒转染,24 h后进行H/R处理;H/R后,采用免疫共沉淀（Co-IP）和免疫荧光（IF）实验检测DJ-1与ND1/NDUFA4蛋白相互作用。以求观察HPC预处理对DJ-1与ND1/NDUFA4蛋白相互作用的影响,且探讨该效应是否会被DJ-1沉默所抑制而被DJ-1外源性高表达所重现。2.H9c2心肌细胞经DJ-1-siRNA瞬时转染培养24 h后建立HPC模型,或经pFLAG-DJ-1重组质粒转染,24 h后进行H/R处理;H/R后,采用分光光度法检测心肌细胞内线粒体复合体I酶活性的变化情况,以求观察沉默DJ-1表达,抑制DJ-1与ND1/NDUFA4蛋白相互作用,是否影响DJ-1蛋白所介导的HPC保护H/R损伤心肌细胞内线粒体复合体I酶活性。3.H9c2心肌细胞经DJ-1-siRNA瞬时转染培养24 h后建立HPC模型,或经pFLAG-DJ-1重组质粒转染,24 h后进行H/R处理;H/R后,采用Mito SOX Red荧光探针检测线粒体ROS的变化,以求观察下调DJ-1蛋白表达,抑制DJ-1与ND1/NDUFA4蛋白相互作用对DJ-1所介导的HPC减少H/R损伤心肌细胞内线粒体ROS生成的影响。4.H9c2心肌细胞经DJ-1-siRNA瞬时转染培养24 h后建立HPC模型,或经pFLAG-DJ-1重组质粒转染,24 h后进行H/R处理;H/R后,通过检测以下指标,观察下调DJ-1表达,抑制DJ-1与ND1/NDUFA4蛋白相互作用,是否影响DJ-1所介导的HPC对抗H/R氧化应激,产生心肌细胞延迟保护的效应:（1）流式细胞术检测细胞内总ROS量;（2）比色法测定MDA的生成量;（3）CCK8法测定细胞存活率;（4）分光光度法测定LDH活性变化。结果:1.在H9c2心肌细胞中,HPC预处理可显著上调DJ-1蛋白表达,同时增强DJ-1与ND1/NDUFA4的蛋白相互作用,这种效应被DJ-1敲低所抑制,而在DJ-1外源性高表达的H9c2心肌细胞被重现。2.H9c2心肌细胞经H/R处理后,细胞内线粒体复合体I酶活性显著降低;而H9c2心肌细胞在H/R前24 h预先经HPC处理后,细胞内线粒体复合体I酶活性显著提高。有趣的是,HPC所产生的上述效应在转染了pFlag-DJ-1重组质粒致DJ-1外源性高表达的H9c2心肌细胞中得于重现。更为重要的是,转染DJ-1-siRNA沉默DJ-1表达,抑制DJ-1与ND1/NDUFA4蛋白相互作用后,HPC所产生的上述效应被抑制。3.H9c2心肌细胞经过H/R处理后,细胞内线粒体ROS产生显著增加,而H/R前24 h经HPC预处理,可显著降低H/R所致的线粒体ROS产生。同样,HPC所产生的上述效应可被DJ-1外源性高表达所重现。而沉默DJ-1表达,抑制DJ-1与ND1/NDUFA4蛋白相互作用,HPC上述效应均被抑制。4.H9c2心肌细胞在H/R前24 h预先经HPC处理后,与单纯H/R组比较,细胞内总ROS及MDA的生成均明显减少、同时细胞生存率明显提高,而LDH活性显著下降。同样,HPC所产生的上述效应在pFlag-DJ-1转染的H9c2心肌细胞中得于重现。更为重要的是,转染DJ-1-siRNA沉默DJ-1表达,抑制DJ-1与ND1/NDUFA4蛋白相互作用后,HPC所产生的上述效应被抑制。结论:上调DJ-1蛋白的表达,进而促进DJ-1与ND1/NDUFA4蛋白相互作用可能是HPC保护线粒体复合体I活性,对抗H/R所诱发的氧化应激,产生心肌细胞延迟保护的分子机制。
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