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环酰亚胺水解酶(Cyclic imide hydrolase，CIH，EC.3.5.2.16)是环酰胺酶中的一个亚类。广泛分布于细菌、真菌与霉菌中，主要催化环酰亚胺类底物的水解反应。CIH有望在药物中间体的制备，异生物质的体内降解中发挥作用，也可作为一种生产有机酸和酶法合成手性化合物的新工具。 本文将来源于Pseudomonas putida YZ-26环酰亚胺水解酶基因克隆到载体pMAL-s中，构建重组质粒pMAL-s-cih，转入E.Coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，利用Amylose column亲和纯化获得带有MBP Tag的环酰亚胺水解酶，融合蛋白经人鼻病毒3C蛋白酶酶切、硫酸铵沉淀、Phenyl-Sepharose疏水层析获得电泳纯的CIH。在此基础上，进一步研究了二价金属离子和金属螯合剂对CIH活性的影响，结果表明1mM的Ni(Ⅱ)、Co(Ⅱ)能分别提高214％和159％酶活力，而Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)对酶的活性存在不同程度的抑制作用，使得CIH剩余活力分别为36％，17％，39％;金属螯合剂处理后的CIH活力明显下降，8-羟基喹啉对CIH的抑制率高达90.6％，EDTA的抑制率为56.4％，2，6-二羧酸吡啶的抑制率为79.2％，以上结果显示了CIH对金属离子具有依赖性。采用ICP-AES测定并比较该酶中二价金属离子的含量，表明每摩尔CIH的亚基中含有一摩尔左右的Zn(Ⅱ);通过去金属离子的环酰亚胺水解酶的Zn(Ⅱ)滴定实验，揭示低浓度的锌离子激活CIH的酶活性，但随着锌离子和CIH的摩尔比大于1后，锌离子对酶的活性则表现为抑制，再次证实了环酰亚胺水解酶的每摩尔亚基可紧密结合大约一摩尔锌。在CIH和Zincon竞争锌离子的实验计算得出CIH和锌离子的结合常数为1.98×106 M-1。由上可推断CIH可能是一个含锌离子的金属依赖性酶。 我们进一步分析了环酰亚胺水解酶与锌的结合位点，利用组氨酸修饰剂二乙基焦磷酰胺(DEPC)和半胱氨酸修饰剂碘代乙酰胺（IAA）修饰CIH，修饰后CIH剩余活性分别为62.4％和51％;经化学修饰的CIH与Zincon竞争结合Zn(Ⅱ)的能力和未处理的酶相比明显下降，由此推测CIH中的组氨酸和半胱氨酸参与锌离子的结合。通过同源序列比对、二级结构预测和Swiss-Model蛋白质结构建模，得到CIH的三维结构模型。该结构显示第7位和108位的半胱氨酸在三级结构空间相近，可能形成二硫键，起到稳定CIH三级结构的作用;第86位、90位、220位、247位的组氨酸与第14位、第176位天冬氨酸形成一个“口袋”结构，这可能就是CIH的锌离子结合区域，Zn(Ⅱ)就通过与该口袋中的第86、247位的组氨酸等氨基酸结合在CIH中。随后我们设计了第86、247位的组氨酸和第7、108位的半胱氨酸被Ala替代的突变酶，这4个突变酶与Zn(Ⅱ)的亲和力明显降低，而且酶的活性基本丧失。CIH的第86、247位的两个组氨酸及第7、108位的两个半胱氨酸可能与Zn(Ⅱ)结合有关。有关环酰亚胺水解酶锌离子结合位点的工作仍在进行中。