论文部分内容阅读
生物催化不对称还原是目前发展最快的生物催化反应之一，具有高度的化学、立体和区域选择性，是化学催化不对称合成的重要补充。其中烯烃还原酶(ene-reductase.EC1.3.1.31)可以催化贫电子烯烃C=C的不对称还原，同时得到1-2个手性中心，是制备手性饱和烷烃类的重要方法之一。烯烃还原酶广泛存在于微生物，尤其是细菌和低等的真菌，以及高等植物甚至寄生虫中。随着基因组测序技术的迅速发展，通过基因狩猎可在大量的基因组数据中挖掘新酶。本论文通过对自主知识产权的两个菌株，无色杆菌JA81(Achromobacter sp.JA81)和金黄杆菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49)进行全基因组测序，并对得到的全基因组框架图进行功能注释，数据挖掘获得新的烯烃还原酶。 首先，提取获得完整高纯度满足全基因组测序要求的无色杆菌JA81和金黄杆菌CA49的基因组DNA。基因组DNA送于深圳华大基因科技有限公司完成全基因组测序。测序的无色杆菌JA81和金黄杆菌CA49建立文库插入的片段长度分别为328bp和500bp，分别获得接近其基因组100倍的原始测序信息数据。基于测序数据组装得到菌株无色杆菌JA81基因组大小为6.5Mb，GC含量为66.70％，金黄杆菌CA49基因组大小为4Mb，GC含量为36.96％。其中无色杆菌JA81的GC含量较高，需要较多的基因组DNA进行测序文库建立。无色杆菌JA81和金黄杆菌CA49两基因组的scaffold N50和contig N50都分别大于20kb和5kb，表明绝大部分预测基因可以得到完整序列，对后续基因预测分析有了长度上的保障。分析测序序列与参考基因组DNA序列的覆盖度高，表明基因组组装结果质量可靠。通过基因预测，无色杆菌JA81含有6，383个基因，金黄杆菌CA49基因组含有3，696个基因。 然后，利用几个关键词如:老黄酶(oldyellow enzyme)等在无色杆菌JA81和金黄杆菌CA49基因组中进行挖掘。总体来说，我们在无色杆菌JA81中挖掘到13个假定烯烃还原酶，在金黄杆菌CA49中挖掘到3个假定烯烃还原酶。其中10个假定的烯烃还原酶属于老黄酶家族，大部分含有约350个氨基酸残基。只有3个假定烯烃还原酶小于350个氨基酸残基，通过对这3个假定烯烃还原酶的上游序列进行重新扩增测序，获得了完整的基因序列和蛋白序列。 其中4个假定的烯烃还原酶在原始菌无色杆菌JA81中翻译转录，未在金黄杆菌CA49中发现假定烯烃还原酶的翻译转录。所有的假定烯烃还原酶能成功的在大肠杆菌中异源表达，全细胞能催化底物2-甲基-N-苯基-马来酰亚胺还原，具有催化C=C还原能力。但是，大部分来源于无色杆菌JA81的假定烯烃还原酶在异源表达体系中以包涵体为主，可溶蛋白较少，无法获得纯蛋白。 进一步研究获得纯蛋白的Achr-OYE6、Achr-OYE7和Chr-OYE2。其中Achr-OYE6和Achr-OYE7具有典型老黄酶吸收光谱特征，与FMN非共价结合，对辅酶NADH和NADPH均可利用。Achr-OYE6的最适反应温度为35℃，在pH7.5-9.0保持较高活性。Achr-OYE7最适反应温度为40℃。最适pH为7.5，在pH6.0-8.0保持较高活性。Achr-OYE6和Achr-OYE7能催化本研究所用的七种不同类型烯烃化合物，对底物2-甲基-N-苯基-马来酰亚胺有较高的转化率。 根据序列分析，在Chr-OYE2中，两个预测的催化关键位点(181位与183位氨基酸残基)分别被Ala以及Met所占据。为了分析缺少保守高度保守的氨基酸残基对Chr-O YE2的影响，通过定点突变的方法，获得回复突变保守的组氨酸和酪氨酸残基的突变子 Chr-OYE2-A181H，Chr-OYE2-M183Y和Chr-OYE2-A181H/M183Y。纯蛋白Chr-OYE2和突变子具有典型老黄酶吸收光谱特征，与FMN非共价结合。Chr-OYE2和突变子对辅酶NADH和NADPH均可利用，更倾向于利用NADH，最适反应温度为30℃。Chr-OYE2和Chr-OYE2-M183Y的最适反应pH为6.5，Chr-OYE2-A181H的最适反应pH为6.0。而Chr-OYE2对烯烃类底物的活性较低。突变子Chr-OYE2-M183Y对2-甲基-N-苯基-马来酰亚胺的转化率和ee值有较大的提高，ee值可达99％。