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microRNA(miRNA)是生物体内一类长度约为22个核苷酸的非编码内源性小分子RNA,参与体内一系列发育和代谢等重要的生理生化过程的调控作用。但其在昆虫与植物关系方面的作用仍不清楚。斜纹夜蛾谷胱甘肽-S-转移酶SlGSTe1是影响农业害虫斜纹夜蛾进食植物的一种重要解毒酶。本论文以SlGSTe1为研究对象,目的在于发现调控SlGSTe1的miRNA,进而探寻在斜纹夜蛾与植物的关系中,是否存在miRNA的精细调控及其可能机制。研究结果如下:
(1)确定与SlGSTe1结合的miRNA
利用从斜纹夜蛾EST文库中预测的58个miRNA和(Rao etal.,2013)斜纹夜蛾进食芥菜(Brassica juncea Coss.var.foliosaBailey)后的miRNA数据库,通过计算机预测,我们得到了可能调控SlGSTe1的miRNA, miR-2771、miR-7、miR-2127、miR-92a-2-5p和miR-2976。双荧光素酶实验证明miR-2771、miR-2127、miR-92a-2-5p可以与SlGSTe13UTR结合。
(2)发现miR-2771可以下调SlGSTe1 mRNA水平,但在体内不直接调控斜纹夜蛾进食植物
分别在5龄斜纹夜蛾和细胞株Spli-221,注射或转染miR-2771模拟物,对照组为NC mimics,并用芥菜或10-4 mol/L芥菜次生物I3C(吲哚-3-甲醇)处理虫子或细胞。发现miR-2771模拟物显著降低斜纹夜蛾中肠或细胞株中SlGSTe1 mRNA水平。
与此同时,发现注射miR-2771模拟物的斜纹夜蛾生长速度变慢,进食芥菜3天后的体重比对照组降低了24%。说明miR-2771通过结合SlGSTe1的3UTR,降解SlGSTe1,使斜纹夜蛾对芥菜次生物质的解毒能力减弱,而影响了斜纹夜蛾的生长。
但是实验也表明斜纹夜蛾中的miR-2771表达量较低,并且并不以斜纹夜蛾进食芥菜而发生变化,表明miR-2771不直接参与斜纹夜蛾与植物的关系。中断斜纹夜蛾进食芥菜6 h后,发现其中miR-2771表达量增加,同时SlGSTe1的mRNA水平下降至平时水平,表明miR-2771的作用在于诱导源去除后及时降解参与应激反应的基因,维护体内平衡。
(3) miR-2127、miR-2976和miR-92a-2-5p的表达量在斜纹夜蛾取食芥菜后下降,而促进SlGSTel的表达斜纹夜蛾进食芥菜两天后miR-92a-2-5p、miR-2127和miR-2976的表达分别下调90%、70%和85%,当中断进食芥菜,虫体内miR-92a-2-5p和miR-2127的表达水平上调至进食前水平。因只有miR-2127和miR-92a-2-5p结合SlGSTe1,所以在斜纹夜蛾进食芥菜过程中,miR-2127和miR-92a-2-5p以自身的降解,解除了对SlGSTe1的抑制作用,使之表达上调,从而使SlGSTe1发挥在斜纹夜蛾进食植物中的作用;而中断进食芥菜后,它们重新合成,并与SlGSTe1结合。
总结上述研究结果,提出了新的miRNA在昆虫进食植物中可能的作用机制:在昆虫进食植物过程中,一类miRNA分子以其自身的降解,促进所靶向的参与应激植物毒性和伤害的基因表达上调;而当昆虫中断进食后,另一类miRNA迅速表达上调,在mRNA水平结合到并降解参与应激作用的基因,同时第一类mRNA再次合成,结合并抑制这些基因的表达,两类miRNA共同作用,使这些基因的表达水平恢复到平常水平,为下次的应答做准备。