论文部分内容阅读
L-苯乳酸（L-phenyllactic acid,L-PLA）是一种高附加值的天然有机酸,对食源性致病菌和腐败菌具有广谱抑菌性,易被人体代谢吸收,可代替防腐剂应用于食品和饲料中。L-PLA作为许多药物和材料的合成前体,在医药和材料领域的重要作用备受关注。目前,报道的关于生物合成L-PLA的产量和生产效率较低,限制了L-PLA的大规模制备。本研究以干酪乳杆菌Lactobacillus casei L-乳酸脱氢酶突变体L-LcLDH1Q88A/I229A为研究对象,通过与葡萄糖脱氢酶共同构建体内和体外辅酶循环体系,并利用体外双酶偶联不对称还原苯丙酮酸（Phenylpyruvate,PPA）,为实现L-PLA的工业化生产奠定基础。利用L-LcLDH1Q88A/I229A和嗜酸热源体Thermoplasma aciddophilium葡萄糖脱氢酶SyGDH,构建体内辅酶循环体系和体外辅酶循环体系。成功构建了共表达重组菌E.coli/pET-22b-Lcldh1Q88A/I229A/pET-28a-Sygdh,利用其不对称还原PPA,反应生成L-PLA的产量明显高于E.coli/pET-22b-Lcldh1Q88A/I229A。对共表达重组菌的表达条件进行优化,在最佳诱导表达条件下（温度15℃、IPTG 0.6 mM、诱导时间12 h）,L-LcLDH1Q88A/I229A的酶活性为158.7 U·g-1（湿菌体）,SyGDH酶活性为44.6 U·g-1（湿菌体）,分别较未优化前提高了17.1%和39.5%。将E.coli/pET-22b-Lcldh1Q88A/I229A、E.coli/pET-28a-Sygdh诱导表达后进行细胞破碎,得到粗酶液,经纯化得到纯酶液。分别将L-LcLDH1Q88A/I229A和SyGDH的粗酶、纯酶偶联,构建体外辅酶循环体系。利用共表达重组菌全细胞、粗酶体系和纯酶体系分别催化10 mM PPA,所得L-PLA的产率分别为86.9%、91.3%、99.6%,只有纯酶体系无副产物生成,因此纯酶体系最适合用于不对称还原PPA制备PLA。为降低酶的制备成本,尝试将L-LcLDH1Q88A/I229A在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中分泌表达以及对SyGDH的粗酶液进行热处理。SDS-PAGE分析显示,毕赤酵母重组酶L-LcLDH1Q88A/I229A（Pp）的表观分子量为36.8 kDa,发酵液中杂蛋白少,比活性为270.5U·mg-1。经纯化后,测定动力学参数,Vmax为627.0 U·mg-1,催化效率kcat/Km为94.3mM-1·s-1,分别是大肠杆菌重组酶L-LcLDH1Q88A/I229A（Ec）的26.1和25.5倍。SyGDH粗酶液经50℃、1 h的热处理,残余酶活性为93.1%,与毕赤酵母发酵液reLcLDH1Q88A/I229A偶联不对称还原10 mM PPA,产率可达99.6%,未产生副产物。优化其催化条件,在40℃、pH 5.0,reLcLDH1Q88A/I229A添加量10 U·mL-1,热处理过的SyGDH添加量1 U·mL-1,NAD+浓度2.0 mM、葡萄糖浓度120 mM的体系中,可在2 h内催化100 mM PPA生成L-PLA的产率为99.2%,辅酶循环数TTN为49.6。为实现辅酶高效循环再生,通过筛选比较,选择亲和NAD+、耐热、耐酸的球形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sphaericus G10来源的葡萄糖脱氢酶突变体LsGDHD255C,代替SyGDH用于体外辅酶循环体系,当NAD+浓度为0.1 mM时,其可在2 h内催化100 mM PPA生成L-PLA的产率为99.5%,辅酶循环数TTN为995,提高了19.1倍。优化LsGDHD255C的添加量,其添加量为4 U·mL-1时,反应时间可缩短至30 min。最后,利用reLcLDH1Q88A/I229A偶联LsGDHD255C的体外辅酶循环体系,在催化反应过程中,通过三次补加PPA,反应最终积累的L-PLA浓度高达359.8 mM,eep>99%,时空产率为10.0g·L-1·h-1,平均转化率为269.3 g·g-1·L-1。分离纯化样品,高手性纯的L-PLA得率为70.6%。