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研究背景与实验目的:结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium,tuberculosis,M.TB)感染引起的传染性疾病,TB的发生和发展与患者的免疫功能,尤其是细胞免疫功能密切相关,其中主要效应细胞为T淋巴细胞。CD4幼稚细胞可分化为Th1、Th2和Th17亚群,IL-17为Th17细胞分泌的主要的细胞因子。有研究发现,在结核性胸水,肺结核支气管灌洗液和外周血中可检测到IL-17 mRNA的表达,提示Th17细胞及IL-17参与了结核的病理过程。而在许多功能上,Th17细胞同调节性T淋巴细胞(Regulatory T cell,Treg)密切相关,控制着体内自身免疫反应,在免疫耐受和动态平衡中起中心作用。Treg细胞数量和功能出现受损,免疫耐受就被打破。在许多慢性炎症,包括结核感染引起的慢性炎症中,IL-17和IFN-γ相互作用可以引起病理性损伤。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)属于细胞外基质蛋白,是可溶性的磷酸化糖蛋白。有研究发现,OPN可以作为细胞因子的一种参与类风湿性关节炎、肝炎、肝癌等多种疾病的发生发展。另外,OPN可通过增加IL-12和IFN-γ分泌而加重结核杆菌感染后肺部的病理性损伤。体外培养巨噬细胞株,感染结核杆菌之后,OPN在培养上清中的水平大幅度增加。这些表明OPN可能参与了 TB的发生发展过程。Th17细胞、Treg细胞、Th17和Treg细胞相关的细胞因子以及OPN对于结核感染的发生、发展及预后都有重要意义,但目前关于疗效和预后的动态观察报道较少,而且Th17细胞、IL-17、Treg细胞在肺结核发病过程中的作用尚存在争议。本课题将通过观察和分析初治痰涂片抗酸染色(Acid Fast Bacilli-smear,AFB)阳性的肺结核患者和经抗结核治疗AFB转阴后外周血IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ、IL-10、OPN、IP-10的水平,以及Treg细胞在治疗过程中的动态变化,进一步阐明肺结核治疗过程中细胞免疫的特征的变化,并探索其中的机制,同时找出评价肺结核治疗效果的可靠指标。研究方法:收集、整理和分析20例AFB阳性的肺结核患者的临床资料和样本,以及对应的20例健康者的资料和样本。流式细胞技术检测20例AFB阳性肺结核患者外周血单个核细胞(PBMCs)中T淋巴细胞、Treg细胞的比例,以及产生IL-17A细胞的类型和比例,酶联免疫斑点实验(Enzyme-linked Immunospot Assay,ELISPOT)检测产生IL-17A的细胞数量,酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测20例AFB阳性肺结核患者治疗前后体内细胞因子IL-17A、IL-23、IL-6、IFN-γ、IL-10,以及OPN、IP-10的水平。同样的方法检测对应的20例健康者相应指标的水平。体外培养肺泡上皮细胞株(A549),加入BCG、IL-17A、IL-10、OPN等刺激,观察细胞株的变化,ELISA法检测培养上清中细胞和因子乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)的水平,研究IL-17A、IL-10、OPN等在结核的发生发展过程中的不同作用,并探索其中可能的机制。体外培养健康者和肺结核患者PBMC,在BCG和OPN等刺激后24h,ELISA方法检测培养上清中细胞因子的水平。研究结果:第一部分AFB阳性患者表达IL-17A的能力较健康对照组明显增加,而经抗结核治疗,痰涂片转阴后,患者IL-17A的水平虽明显下降,但是仍然高于健康对照的水平。同时与健康对照组比较,AFB阳性患者表达IL-23、IL-6、IFN-y的能力亦显著增加。流式细胞技术分析,在AFB阳性的患者中产生IL-17A细胞类型除了经典T细胞(CD3+CD56-)外,CD3+CD56+NKTlike细胞是另一个主要来源。Treg细胞以及其分泌的细胞因子IL-10能够抑制Th17细胞分泌IL-17A。IL-17A与血液中C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和红细胞沉降率(Eythrocyte Sedimentation Rate,ESR)呈正相关,而与IL-10呈负相关。体外实验发现IL-17A能够诱导肺泡上皮细胞株的凋亡增加,而且能够加重BCG引起的肺泡上皮细胞损伤,而IL-10能够抑制IL-17A对肺泡上皮细胞的损伤作用。第二部分OPN血浆中的水平在AFB阳性的患者中较健康对照组明显的升高,AFB转阴后又明显的下降,AFB阳性合并结核性胸水(TPE)患者OPN的表达水平明显高于AFB阳性未合并TPE的患者的水平。并且OPN与CRP呈明显正相关。OPN能够促进γ干扰素诱导蛋白10(IFN-γ-induced protein 10,IP-10)的表达,IP-10在痰涂片阳性的患者中表达也明显的升高。OPN和IP-10只有在痰涂片转阴后才有明显的下降。同时,BCG能够促进肺泡上皮细胞分泌OPN,而OPN能够促进肺泡上皮细胞分泌IP-10,同样的OPN能够促进健康者和肺结核患者PBMC产生IP-10、IL-12、IFN-y,而加入IFN-y中和抗体后,PBMC分泌IP-10和IL-12的能力显著降低。结论:在结核分枝杆菌感染过程中,IL-17A能够诱导肺损伤,CD3+CD56+ NKT like细胞为AFB阳性的肺结核患者IL-17A的重要来源。在结核的发展过程中,Treg细胞及其分泌的细胞因子IL-10可以抑制IL-17A引起的肺损伤。OPN能够诱导结核感染引起的肺损伤,OPN和IP-10可能成为判断结核治疗效果的新指标。