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第一部分 MIA2基因载体构建及表达转染体系的建立目的构建慢病毒表达载体p LVX-IRES-Zs Green1,转染Hep G2细胞并检测转染细胞中MIA2的表达水平,以建立其转染表达体系,为进一步研究MIA2功能及分子信号通路提供研究基础。方法以p DONR223-MIA2为模板,PCR扩增MIA2,在分别用带有酶切位点:Spe I、Bam HI MIA2基因扩增上下游引物,用Spe I、Bam HI双酶切载体p LVX-IRES-Zs Green1和PCR产物,胶体回收后进行MIA2和p LVX-IRES-Zs Green1连接,重组质粒经Ca Cl2法转化至DH5α感受态细胞,并用Spe I、Bam HI及测序鉴定质粒p LVX-IRES-Zs Green1中插入MIA2基因的完整性。重组质粒p LVX-IRES-Zs Green1-MIA2转染Hep G2细胞,荧光显微镜观察基因表达强度和转染效率,并对转染细胞的MIA2经行荧光定量PCR、免疫组化及Western Blot检测。结果重组质粒p LVX-IRES-Zs Green1-MIA2经酶切及测序鉴定,其插入的MIA2基因序列与Gene Bank提供的序列完全吻合,用p LVX-IRES-Zs Green1转染Hep G2细胞转染效率高达60%重组转染Hep G2细胞MIA2m RNA水平比空载体转染组高,免疫组化和Western Blot检测表明,转染p LVX-IRES-Zs Green1-MIA2高表达MIA2蛋白。结论成功构建真核表达载体p LVX-IRES-Zs Green1-MIA2,转染了Hep G2细胞建立了p LVX-IRES-Zs Green1-MIA2重组质粒体外表达体系。第二部分 MIA2对肝癌细胞Hep G2生长及对AKT信号转导的影响目的探讨黑色素瘤抑制蛋白2(MIA2)对人肝癌细胞Hep G2生长的抑制作用,并阐明分子机制是否涉及通过上调AKT信号途径。方法以Hep G2细胞为实验对象,分别用p IRES2-Zs Green1(NC)、p IRES2-Zs Green1-MIA2(MIA2)转染Hep G2细胞,分别在在转染4、24、48、72h后进行MTT检测细胞增殖抑制率。两组细胞培养48、72h进行流式凋亡检测。Western blot法分析AKT1蛋白表达水平。结果MTT与对照组相比,MIA2组的细胞增殖水平明显减少(P<0.05)。RT-PCR及Western blot结果显示与对照组相比AKT1基因蛋白表达水平上调。结论MIA2促进Hep G2细胞凋亡通过上调AKT1的表达抑制肝脏肿瘤的发生。