【摘 要】
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目的：构建用于异种移植的新型基因改造猪,在原有的α1,3-半乳糖基转移酶(α=Gal)基因敲除以及腹膜蛋白(CD46)、血栓调节蛋白(TM)基因转入的猪胎儿成纤维细胞基础上,进一步将II
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目的：构建用于异种移植的新型基因改造猪,在原有的α1,3-半乳糖基转移酶(α=Gal)基因敲除以及腹膜蛋白(CD46)、血栓调节蛋白(TM)基因转入的猪胎儿成纤维细胞基础上,进一步将II类反式激活因子显性负向(CIITA-DN)基因转入猪的基因组,以抑制猪白细胞抗原SLA (MHC) Ⅱ类分子的表达,从而更加有效地克服多方面的免疫排斥反应。方法：设计合成博来霉素(Zeocin)抗性基因片段BGH-loxp-Zeo-Sv40pa-loxp,插入pMD-108T载体,再利用限制性内切酶将其与含有CIITA-DN基因的pST205载体连接,构建置于人Tie2增强子和CMV β-actin启动子之下的CIITA-DN表达载体pNMU105,将线性化的pNMU105通过脂质体转染法转入已经敲除了α-Gal并转入了CD46、TM基因的猪胎儿成纤维细胞181B(DKO/CD46/TM) DKO/CD46/TM转基因的猪胎儿成纤维细胞(181B), Zeocin抗性筛选转染pNMU105质粒的181B细胞,PCR方法检测CIITA-DN基因在181B细胞中的转入,获得阳性克隆并进行核移植,得到DKO/CD46/TM/CIITA-DN转基因猪。取仔猪的耳组织进行基因鉴定。结果：成功构建pNMU105/CIITA-DN表达载体,转入181B (DKO/CD46/TM)细胞并经过Zeocin抗性药物筛选获得多株阳性单克隆,顺利通过核移植得到DKO/CD46/TM/CIITA-DN转基因猪。仔猪组织经PCR鉴定,在592bp位置检测到预期条带,证明均为CIITA-DN转基因阳性。结论：通过数种异种移植免疫反应相关基因的改造,在抑制超急性排斥和补体反应、降低凝血和人CD4+T细胞免疫反应的理论基础上,得到了α-Gal基因敲除以及CD46、TM与CIITA-DN基因转入的新型基因克隆猪。为异种器官移植中更加有效地减少免疫损伤、提高移植器官的存活率做出了新的尝试。
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