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香蕉(Musa spp.)是世界上最重要的果树之一,主栽品种均为三倍体。香蕉胚性细胞悬浮系(ECS)的建立及体细胞胚发生途径植株的再生是通过生物技术创新其种质水平的关键。然而,香蕉是一种胚性反应非常顽拗的植物,其体细胞胚发生的困难严重制约了生物技术在香蕉种质创新中的应用。乙烯与植物体细胞胚发生密切相关,但乙烯在香蕉体细胞胚发生过程中的作用还不清楚。为了更好了解香蕉的ECS、提高香蕉的体细胞胚发生能力,本研究以‘粤优抗1号’(Musa spp. AAA)、‘广东2号’(Musa spp. AAA)、‘巴西蕉’(Musa spp. AAA)的ECS为试材,采用电镜对其超微结构进行观察,分别在ECS悬浮培养、体细胞胚再生、成熟与萌发阶段的培养基中添加乙烯释放剂、乙烯合成前体、乙烯作用/合成抑制剂、乙烯吸收剂来调控乙烯含量,研究乙烯对香蕉球形胚发生能力、体细胞胚萌发率、ECS植株再生能力的影响及其对ACO(1—氨基环丙烷—1—羧酸氧化酶)基因在经处理过的ECS中的表达的影响。获得的主要研究结果如下:
(1)环境扫描电镜观察发现香蕉的胚性细胞表面具有许多皱褶,细胞团内各细胞之间结合紧密无空隙,部分胚性细胞表面有细胞间表面网络矩阵(ECMSN);透射电镜观察结果表明:香蕉胚性细胞直径通常都小于20μm,具有完整的细胞结构,细胞中有一个近圆形的细胞核、核仁明显,质膜平滑面规则,细胞质中含有许多大小不等的液泡和大量的细胞器,代谢旺盛。
(2)香蕉ECS阶段进行乙烯调控后,胚性细胞在1周的继代培养过程中质量的增长率均表现下降,乙烯释放量与质量增长呈显著负相关;经乙烯处理后的ECS,在后续的体细胞胚发生途径再生过程中,除STS处理因能显著提高体细胞萌发率从而提高植株再生能力外,其他各处理均降低了香蕉体细胞胚的发生。
(3) RD1—1阶段(体细胞胚再生培养基前两周半)AOA处理提高了球形胚发生能力,STS处理结果相反;在后续的体细胞胚发生途径植株再生过程中,ACC和乙烯吸收剂能显著提高体细胞胚萌发率与植株再生能力,其他各处理与对照间无显著差异。RD1—2阶段(体细胞胚再生培养基后两周半)各处理均有利于球形胚发生能力的提高,尤以乙烯吸收剂效果最好(2.57×104个/g);在后续的体细胞胚发生途径植株再生过程中,AOA、乙烯利和乙烯吸收剂3个处理能显著提高体细胞胚萌发率和ECS的植株再生能力,其余两个处理与对照间无显著差异。
(4)RD2—1(体细胞胚成熟与萌发培养基前两周)阶段乙烯处理对培养瓶中乙烯浓度没有显著影响,但与RD1—2阶段类似,AOA、乙烯利和乙烯吸收剂3个处理能显著提高体细胞胚萌发率,从而也提高ECS的植株再生能力,尤以乙烯利处理的效果为最佳;RD2—2阶段(体细胞胚成熟与萌发培养基后两周)进行乙烯调控各处理均降低了培养瓶中乙烯的浓度,除乙烯吸收剂处理能显著提高体细胞胚萌发率和植株再生能力外,其他各处理均与对照间没有显著差异。
(5)通过RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)法从香蕉的NECS中分别克隆了1个ACO基因片段和1个全长ACO基因,它们与Gene Bank上登录的从香蕉果皮中克隆的AF004839和AF081917两个ACO基因的核苷酸序列同源性分别高达90%和99%。通过Northenr Blot初步检测了乙烯调控对ACO基因在ECS中表达量的影响,结果表明:经乙烯吸收剂、乙烯利、STS处理的其表达量与CK的接近,而经AOA、ACC处理的其表达量较少。