拟南芥DnaJ-like锌指蛋白ORANGE与UBC19的相互作用研究

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Orange(Or)基因最初从菜头呈橘黄色的花椰菜天然突变体中得到克隆、鉴定。突变体菜头细胞中的白色体向有色体分化,大量积累类胡萝卜素。Or基因编码一个DnaJ-like富含半胱氨酸的锌指蛋白,其序列在植物中高度保守。后续的研究证明,不管是花椰菜的野生型Or基因还是其突变体中带有反转座子插入的or基因,亦或是其他植物中Or的同源基因,都能促进有色体的发育,诱导类胡萝卜素的积累。进一步研究表明,花椰菜OR蛋白能够与真核翻译释放因子eRF1-2在细胞核中相互作用,负调控eRF1家族基因的表达,影响叶柄伸长。OR也能够与八氢番茄红素合酶(phytoene synthase,PSY)在质体中相互作用,促进PSY的酶促活性和类胡萝卜素的生物合成。  最初的研究显示OR是一个定位在质体表面的蛋白,而随后的研究发现花椰菜和甘薯中的OR蛋白都可以定位在细胞核内。我们实验室的工作证明了拟南芥中OR能够同时定位于叶绿体及细胞核中。在黄化的子叶里,OR主要定位在细胞核,随着幼苗见光并开始去黄化,细胞核里OR的含量逐渐降低。同时我们还发现,在去黄化期间OR能与bHLH转录调节因子TCP14相互作用,调控色素积累和质体去黄化进程。但是OR双定位的调控机制以及其发挥功能的作用机制,目前尚不清楚。  本研究通过酵母双杂交筛库发现拟南芥OR蛋白能与UBC19在酵母体内相互作用,并且通过酵母双杂交进行了验证。通过进化分析,我们发现UBC20与UBC19序列高度一致。但是酵母双杂交表明,OR与UBC20没有相互作用。这说明OR与UBC19的相互作用是特异的。组织表达分析表明,Or和UBC19均在叶、花和果荚高表达,在其他组织中表达量较低,且表达模式相似。我们进一步用GST Pull-down实验证明OR能够和UBC19在体外相互作用。通过农杆菌介导的遗传转化结合免疫共沉淀,发现UBC19与OR在植物体内的相互作用导致OR被泛素化。亚细胞定位表明,UBC19主要定位在细胞核,细胞质中也有分布。我们检测了去黄化期间,Or与UBC19的转录水平。在24h内,Or和UBC19的表达水平都有显著上调,这表明Or与UBC19可能共同参与了去黄化过程。见光36h后,Or的表达水平仍然在升高,而UBC19的表达水平则有明显降低,可能在此之前,去黄化过程就已经完成。  根据研究结果,我们推测OR与UBC19的相互作用调控了子叶发育初期OR的亚细胞定位,并通过这一调控来影响植物的去黄化过程。
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