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背景:肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球范围内癌症死亡人数排名第二的恶性肿瘤,同时也是我国发病率第三的恶性肿瘤,我国肝癌死亡人数占全球一半以上。早期肝细胞肝癌患者的5年生存率可以达到70%以上,然而,晚期肝细胞肝癌患者的中位生存期通常不到一年。因此,HCC患者的早期诊断对于患者的生存以及治疗至关重要。目前,美国国家综合癌症网络（NCCN）指南建议使用X线计算机断层扫描（CT）和动态磁共振成像（MRI）作为HCC常用的诊断手段。但是,CT与MRI对肝细胞肝癌诊断的敏感性（62.0-78.4%）较低,特别是对于微小肝癌（≤2cm3）。这也就意味着CT以及MRI不适合作为肝细胞肝癌的早期诊断技术,肝细胞肝癌缺乏有效的早期诊断手段。使用2-脱氧-2-(18F)氟-D-葡萄糖(18F-FDG)作为示踪剂的正电子发射断层扫描（PET）与CT成像结合的PET/CT被广泛应用于恶性肿瘤的早期诊断以及肿瘤的疗效监测等,然而,18F-FDG在HCC细胞中的积聚水平通常较低,特别是在高分化的HCC细胞中。因此,NCCN指南中明确指出18F-FDG PET/CT成像目前不推荐作为肝细胞肝癌的诊断手段。18F-FDG通过葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）转运进入肿瘤细胞,然后被己糖激酶2（HK2）磷酸化,从而使带电的18F-FDG-6-磷酸在细胞内集聚。由于肝细胞肝癌内高表达葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）,它可以将18F-FDG-6-磷酸水解成18F-FDG,然后通过葡萄糖转运蛋白和P-糖蛋白被转运出肝癌细胞,这也就是高分化肝癌细胞18F-FDG低摄取的原因。因此,选择性抑制G6Pase活性可能会导致更高浓度的18F-FDG在HCC细胞中积累,这将有利于18F-FDG PET/CT成像用于HCC肿瘤的诊断。二甲双胍（Met）是应用于2型糖尿病治疗的一线药物,二甲双胍对正常细胞以及肿瘤细胞的糖代谢都发挥了重要的作用。二甲双胍通过降低细胞内G6Pase mRNA水平,可以有效地下调G6Pase表达。叉头转录因子的亚型O1（FoxO1）是在调节糖代谢和肿瘤进展中起重要作用的一个转录因子,二甲双胍可以对巨噬细胞中的FoxO1表达具有强烈的抑制作用。在其非磷酸化状态下,FoxO1可以增加G6Pase转录水平提高肝葡萄糖的产生速率。同时研究表明抑制FoxO1活性可以降低肝脏中G6Pase的表达水平。因此我们研究二甲双胍是否可以通过降低肝癌细胞FoxO1的表达继而降低G6Pase的表达水平,最终提高肝癌细胞内18F-FDG摄取。目的:改善肝癌细胞对18F-FDG的低摄取、提升PET/CT在肝细胞肝癌早期诊断中的应用价值,最终全面揭示二甲双胍与FoxO1在肝癌糖代谢方面的作用。方法:1、通过quantitative RT-PCR和Western blotting技术检测二甲双胍及FoxO1-siRNA干预对肝癌细胞SMMC-7721、HepG2内FoxO1和G6Pase的转录及蛋白水平的影响,并检测二甲双胍干预对肝癌细胞葡萄糖转运关键蛋白GLUT1和HK2的影响。2、构建多西环素（Dox）诱导下FoxO1敲除以及FoxO1过表达的SMMC-7721细胞系,并研究二甲双胍与FoxO1的相互作用对G6Pase表达的影响。3、体外检测二甲双胍以及FoxO1-siRNA对肝癌细胞SMMC-7721以及HepG218F-FDG摄取的影响。4、制备Dox诱导下FoxO1敲除以及FoxO1过表达的SMMC-7721裸鼠移植瘤模型。通过腹腔注射二甲双胍（250 mg/kg/day）以及多西环素0.2mL（2 mg/mL）灌胃诱导FoxO1敲除以及FoxO1过表达后行18F-FDG PET/CT显像,在体内水平研究二甲双胍及FoxO1-KD对肝癌细胞18F-FDG摄取的影响。5、通过免疫组化以及Western blotting技术检测二甲双胍、Dox干预后离体肿瘤组织G6Pase、GLUT1以及HK2表达水平,进一步验证二甲双胍和FoxO1-KD在体对G6Pase、GLUT1以及HK2的影响。结果:1、在体外水平,使用未经处理的肝癌细胞作为参照,FoxO1的表达水平在二甲双胍处理以及FoxO1-siRNA干预下均显着降低,尤其是Met10 mM组（0 mM1.000±0.058 vs.10 mM 0.561±0.052,P=0.0048）和FoxO1-siRNA组（0 mM1.000±0.058 vs.FoxO1-siRNA 0.495±0.0232,P=0.0031）。但是,在二甲双胍处理的各组中,FoxO1的转录水平没有显着改变（P=0.6512）,同时,磷酸化的FoxO1与总FoxO1的比例在蛋白水平没有改变（p-FoxO1/FoxO1:F=0.1116,P=0.9756）,提示二甲双胍降低FoxO1表达水平的机制可能通过转录后调控。为了进一步解释其具体机制,对控制FoxO1转录后翻译的上游蛋白的表达水平进行研究。发现使用二甲双胍可以导致AMPK磷酸化水平增加（0 mM 1.000±0.0833 vs.10 mM 1.424±0.3789,P=0.0097）,而Akt磷酸化水平和4EBP1磷酸化水平下降（0 mM 1.000±0.1217 vs.10mM 0.3758±0.0372,P=0.0083;Met 0 mM 1.000±0.0752vs.10 mM 0.364±0.0347,P=0.0016）。这表明Met通过对AMPK-Akt-4EBP1通路的抑制作用影响FoxO1的表达水平。此外,肝癌细胞对18F-FDG的摄取在FoxO1-siRNA干预后也显著高于对照组（1.244±0.0630 vs.0.421±0.0487,P=0.0005）。2、二甲双胍以及FoxO1-siRNA处理SMMC-7721细胞系后,G6Pase的转录及蛋白水平均明显下降。在转录水平二甲双胍处理组（0 mM 1.000±0.0893 vs.1 mM0.5271±0.048,P=0.0096;5 mM 0.053±0.0055,P=0.0005;10 mM 0.0448±0.0068,P=0.0004）和FoxO1-KD组（0 mM 1.000±0.0893 vs.FoxO1-siRNA 0.0287±0.0037,P=0.0004）较未干预组G6Pase转录水平下降。二甲双胍处理组（0 mM 1.000±0.0921vs.1 mM 1.008±0.1101,P=0.9602;5 mM 0.6655±0.0652,P=0.0413;10 mM0.5621±0.0974,P=0.0309）FoxO1-KD组（0 mM 1.000±0.0921 vs.FoxO1-siRNA0.4247±0.0841,P=0.0099）较未干预组G6Pase蛋白水平也下降。使用Dox诱导FoxO1-OE可以增加SMMC-7721细胞FoxO1的表达,并且增加G6Pase的表达水平。另外,使用Met干预可以减少Dox诱导FoxO1-OE对FoxO1的影响（2.656±0.0959 vs.3.548±0.1700,P=0.0038）和G6Pase表达（1.323±0.0492 vs.2.177±0.1348,P=0.0011）。这表明Met可以部分逆转Dox诱导的FoxO1和G6Pase过表达,Met和FoxO1都有对G6Pase转录和表达水平有调节作用。此外,二甲双胍对细胞18F-FDG摄取关键蛋白GLUT1及HK2表达并无明显影响（F=0.8935 P=0.5027;F=0.3387 P=0.8459）。3、在体外使用Met处理SMMC-7721及HepG2细胞可以增加细胞18F-FDG的摄取,并呈剂量依赖性增加。当Met使用浓度达到10 mM时,SMMC-7721细胞对18F-FDG的摄取较未干预组中增加了3.5倍（1.474±0.0946 vs.0.421±0.0487,P=0.0006）。4、在体内实验中,Met干预2天后,裸鼠肿瘤组织的SUVMax值和T/NT比值均明显增加:FoxO1-KD小鼠(SUVMax Met 1.907±0.139 vs.NC 0.443±0.022,P=0.0005;T/NT Met 3.678±0.131 vs.NC 1.037±0.0185,P<0.0001)和FoxO1-OE小鼠(SUVMaxax Met 1.764±0.057 vs.NC 0.407±0.018,P<0.0001;T/NT Met 3.769±0.098 vs.NC1.019±0.018,P<0.0001)。在FoxO1-KD小鼠中,Dox诱导的FoxO1敲除同样可以增加肿瘤组织18F-FDG摄取(SUVMax Dox 1.013±0.055 vs.NC 0.443±0.022,P=0.0006;T/NT:Dox 3.065±0.049 vs.NC 1.037±0.0185,P<0.0001)。但是,Dox诱导FoxO1-OE小鼠导致FoxO1过表达能够逆转Met增加肿瘤18F-FDG摄取的作用。(SUVMax Dox 0.533±0.064 vs.Met 1.764±0.057,P=0.0001;T/NT Dox 1.287±0.099 vs.Met 3.769±0.098,P<0.0001)。这些结果证实了二甲双胍以及FoxO1均对调节18F-FDG在HCC细胞中的摄取中起着重要作用。5、二甲双胍干预后肝癌肿瘤组织G6Pase蛋白水平下调（NC 1.000±0.1574 vs.Met 0.3156±0.06117,p=0.0154）,同样,使用Dox诱导FoxO1-KD后,肝癌肿瘤组织G6Pase蛋白水平下调（NC 1.000±0.1574 vs.FoxO1-KD 0.2750±0.03244,P=0.0107）,而18F-FDG摄取的相关蛋白HK2以及GLUT1没有发生改变。结论:体内外研究表明二甲双胍可通过减少G6Pase的表达显著增加18F-FDG在SMMC-7721肝癌细胞的摄取。FoxO1是介导二甲双胍调节G6Pase表达和18F-FDG摄取的关键因素。二甲双胍干预和FoxO1抑制可能是18F-FDG PET/CT早期诊断HCC的潜在策略。