论文部分内容阅读
目的：
先天性马蹄内翻足(idiopathiccongenitaltalipesequinovarus,ICTEV)是一种较常见的足踝部先天畸形。然而该病的发生机制还不清楚,目前普遍接受的观点为ICTEV的发生是环境因素与遗传因素共同作用的结果。另外,ICTEV是一种复杂疾病,其发生与多个基因相关,可能是多个微效基因共同作用形成了ICTEV畸形。
Lochmiller报道24.2%的ICTEV患者有家族史,患者Ⅰ型胶原明显增加,比例失常。Ippolito研究表明在患者病足的小腿后内侧肌肉里,肌腱腱鞘及筋膜中纤维组织明显增加,推测软组织挛缩可能是ICTEV畸形原发病因。本课题组前期实验提示C/EBPβ与COL9A1可能同时存在于人足踝部肌肉组织肌膜、肌内膜、肌外膜的结缔组织中,正是Ⅰ型胶原集中的部位,并且已证实COL9A1基因与ICTEV畸形发生相关,同时,通过基因截短实验及P-Match软件预测到COL9A1基因近端启动子-403～-275bp之间可能存在C/EBPp结合位点。人C/EBPβ基因(GenBankGeneID:1051)属于C/EBPs(CCAATenhancerbindingproteins)亮氨酸拉链转录因子家族。目前研究已证实C/EBPβ参与细胞分化、组织损伤修复、炎症反应、细胞周期调控等多种重要的生命活动,且功能受到磷酸化、乙酰化、蛋白质相互作用等多种途径的调控,但是否与ICTEV发生相关国内外未见报道。因此,本研究在分子水平对人C/EBPβ基因在同龄对照及ICTEV患者足踝部肌肉组织中表达水平和其对COL9A1的调控机制进行了初步探讨。
材料与方法：
1、实验材料
84例ICTEV患者外周静脉血及15例ICTEV患者足踝部肌肉组织标本(主要为(足母)长屈肌)由中国医科大学附属第二临床医院小儿外科提供。6例同龄对照(非ICTEV患者)足踝部肌肉组织标本由中国医科大学法医学院提供。所有标本使用均经患者知情同意。
大鼠成肌细胞株L6购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。
2、实验方法
1、Real-timePCR方法检测C/EBPβ在ICTEV患者与同龄对照(非ICTEV患者)足踝部肌肉组织中的表达。
2、WesternBlot及免疫组织化学方法检测C/EBPβ在ICTEV患者与同龄对照(非ICTEV患者)足踝部肌肉组织中的表达。
3、应用变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)检测84例ICTEV患者外周血中C/EBPβ基因编码区突变。
4、应用P-Match软件预测人COL9A1基因5上游序列可能的转录因子结合位点。
5、应用激光扫描共聚焦显微镜观察C/EBPβ与COL9A1蛋白的表达。
6、应用染色质免疫沉淀实验(ChIP)及凝胶迁移实验(EMSA)分别在体内及体外验证C/EBPβ蛋白与COL9A1基因启动子区预测C/EBPp结合位点的结合作用。
7、C/EBPβ表达抑制及过表达实验验证C/EBPp对COL9A1基因的调控关系。
结果：
1、C/EBPβ在ICTEV患者足踝部肌肉组织中mRNA及蛋白水平表达均明显低于正常对照组织(P＜0.05)。
2、84例ICTEV患者外周血中未发现C/EBPβ基因编码区突变。
3、P-Match软件预测结果提示COL9A1基因近端启动子-403～-275bp之间可能存在C/EBPβ转录因子的结合位点。
4、激光扫描共聚焦显微镜显示在ICTEV患者肌肉组织中C/EBPβ与COL9A1同时表达于肌膜、肌内膜及肌束膜内,且位置重合。
5、ChIP、EMSM实验在体内及体外证实在COL9A1基因近端启动子-373～-353bp区域存在转录因子C/EBPβ的结合位点。
6、表达抑制实验结果显示,C/EBPβ的低表达可能导致COL9A1基因表达升高。
7、过表达实验结果显示,C/EBPβ的高表达可能导致COL9A1基因表达降低。
结论：
1、C/EBPB在ICTEV患者足踝部肌肉组织中的低表达可能与ICTEV畸形的发生相关,而C/EBPβ基因编码区突变可能不是ICTEV发病的原因。
2、C/EBPβ能与COL9A1基因近端启动子-373～-353bp区域直接结合,从而负调控COL9A1基因的表达,这可能与ICTEV畸形发生相关。