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目的:乳腺癌是威胁女性身心健康的最常见的恶性肿瘤之一,在所有导致女性死亡的肿瘤中位居第二。近年来其发病率呈快速上升的趋势,且发病年龄趋于年轻化。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(PTPN11)是酪氨酸磷酸酶家族(PTPs)中的重要成员,也是目前该家族中唯一被证实的原癌基因。近年来研究发现SHP2常高表达于包括乳腺癌在内的许多人类实体瘤中,且在部分乳腺癌患者群体中存在点突变,提示SHP2可能与乳腺癌的发生及恶化具有密切的相关性,但具体调控机理仍不清楚。SHP2分子包含1个的PTP磷酸酶活性区域及2个SH2结构域(N-SH2,C-SH2),结构位点突变可能导致SHP2酶活性改变及与其它功能分子间的衔接异常,进而参与调控细胞癌变及癌细胞转移。
本课题旨在研究SHP2在调控乳腺癌的生物学功能及结构基础并对分子机制进行初步探讨。
方法:①Western Blotting检测临床实体瘤样本(包括乳腺癌,肺癌,鼻咽癌,胃癌,胶质瘤,结直肠癌)及乳腺癌细胞系中SHP2蛋白的表达情况。②构建hSHP2-shRNA质粒,外源性转入乳腺癌细胞,利用xCELLigence微电子传感器系统、MTT等方法检测SHP2表达沉默对细胞生物学功能的影响。同时利用SHP2抑制剂处理并观察PTP酶活性缺失对细胞生物学功能的影响。③体外构建常见群体疾病相关的PTPN11基因定点突变质粒,外源性转入乳腺癌细胞,探讨其影响细胞生物学功能的结构基础。④初步探讨SHP2(PTPN11)重要结构突变体的分子调控机制,特别是对ERK/MAPK信号传导通路的影响。
结果:①在检测过的实体瘤样本中SHP2在癌组织中均呈现不同程度的高表达,且在乳腺癌及乳腺癌细胞系中显著上调。②SHP2表达沉默后乳腺癌细胞系粘附明显增强,而增殖能力及EGF介导的细胞骨架重排显著下降,经SHP2磷酸酶抑制剂处理后EGF介导的乳腺癌细胞骨架重排能力下降,而粘附能力没有明显影响。③成功构建30多种常见群体疾病相关的PTPN11基因定点突变质粒;经xCELLigence高通量微电子传感器系统筛选发现SHP2分子结构中D61G,T73I,I282V,T468M位点突变在乳腺癌细胞增殖过程中发挥重要调控功能;经进一步筛选发现E69K,E76A,T73I,1282V位点突变通过EGF介导的ERK/MAPK信号参与调控细胞骨架重排。