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U-box蛋白在植物中广泛存在说明该类蛋白在植物体内发挥重要作用。很多U-box蛋白具有泛素连接酶E3活性以及在泛素化过程中特异地识别靶标蛋白等生理生化功能。AtPUB4蛋白是在拟南芥中最新发现的具有E3连接酶活性的PUB蛋白,研究表明AtPUB4基因能影响花粉绒毡层细胞的生长发育,利用其特性有可能创制温敏型雄性不育材料。蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)是豆科苜蓿属的一年生草本植物。二倍体,具有生育期短、基因组小、自花授粉、易于转化、再生时间较短等特点,被作为豆科模式植物进行研究,2011年已完成全基因组测序。目前,有关蒺藜苜蓿U-box基因家族的研究尚未见报道。本试验克隆两个蒺藜苜蓿U-box基因MtPUB1和MtPUB2,通过生物信息学及生物技术手段分析了克隆基因结构、亚细胞定位、原核表达及基因的表达特性,成功构建了植物表达载体对拟南芥进行遗传转化。最后对MtPUB基因家族进化过程进行了分析。研究结果如下:1.利用同源克隆法获得蒺藜苜蓿MtPUB1和MtPUB2基因,该基因cDNA全长2448和2400bp,分别编码815和799个氨基酸,蛋白分子量为88.36 KDa和87.96 KDa,两个蛋白都是疏水性蛋白,无信号肽和跨膜结构。2.亚细胞定位预测MtPUB1基因定位在细胞质,MtPUB2基因定位在线粒体基质。构建原核表达载体,获得MtPUB1蛋白。3.利用实时荧光定量PCR分析MtPUB1和MtPUB2基因在蒺藜苜蓿不同组织的表达特异性,结果表明MtPUB1基因在花中表达量最高,MtPUB2在茎中表达量最高,两个基因在根部表达量最低。MtPUB1在NaCl、PEG、ABA诱导后,表达量上升,低温诱导表达量变化不明显。MtPUB2在NaCl诱导后表达量下降,在PEG、ABA及低温诱导下表达量都呈现出上升趋势。4.构建植物表达载体pBI121-MtPUB1和pBI121-MtPUB2,采用农杆菌介导法转化拟南芥Atpub4突变体,通过卡纳抗性筛选和PCR、RT-PCR检测后,获得MtPUB1的T1代转基因拟南芥种子。经过对转化拟南芥突变体和野生型拟南芥花粉扫描电镜观测,花粉改变不明显。5.通过对MtPUB基因的功能歧化分析,U-box和ARM两种功能结构域的主要歧化位点位于3个保守的基序上,在此基础上定位了9个歧化位点。6.对MtPUB基因序列选择压力的分析结果表明,MtPUB基因在强的负选择压力下经过复制后保留发挥基因功能,其中114个负选择位点所在序列与多序列联配获得保守序列相符,推测这一区域可使MtPUB蛋白与PREDEN发生特异性结合,因此产生不同功能。