论文部分内容阅读
目的： 探讨 Exendin-4（ Ex-4）对高糖环境下人牙周膜干细胞（Periodontal Ligament Stem Cells，PDLSCs）增殖及成骨分化能力的影响，并对其机制进行初步研究。 方法： 第一部分：通过体外组织块法分离培养人PDLSCs，并通过克隆形成能力和多向分化（成骨和成脂）能力检测其干细胞特性。 第二部分：分别用不同浓度的 Ex-4（1,10,20,100nM）处理正常人PDLSCs（NG组）和高糖环境下（30mM葡萄糖）的人PDLSCs（HG组），采用CCK-8试验检测细胞增殖能力。选取10nM Ex-4处理，实验共分四组，分别为NG组，NG+Ex-4组，HG组，HG+Ex-4组，流式细胞术检测细胞周期。针对上述四组分别成骨诱导7,14,21d，采用茜素红染色评估矿化结节的形成并进行定量分析，通过实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测成骨相关基因：Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor2，Runx2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）及骨保护素(Osterix, Osx)的表达情况。 第三部分：取对数生长期的 PDLSCs，分为 NG组，NG+Ex-4， HG组，HG+Ex-4组（所用Ex-4均为10nM）共四组。通过2′,7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(CM-H2DCF-DA)探针检测细胞内活性氧（ROS）水平，并进行定量分析。采用 RT-PCR对细胞内糖基化终末产物受体（RAGE）mRNA表达水平进行检测。分别对上述四组细胞进行成骨诱导，采用ERK1/2（细胞外调节蛋白激酶）抑制剂PD98059处理，检测成骨相关基因Runx2，ALP和Osx的表达水平。 结果： 第一部分： 1.本研究在体外成功分离培养出人PDLSCs。 2.结晶紫染色提示该细胞具有较强的克隆形成能力。 3.茜素红和油红染色提示该细胞具备成骨及成脂向分化能力。 第二部分： 1. CCK-8检测结果显示，与NG组相比，HG组PDLSCs的增殖能力受到明显抑制（P＜0.05）。NG组与 NG+Ex-4组差异无统计学意义（P＞0.05），HG+ Ex-4组（1,10,20,100nM）增殖能力明显强于HG组，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中，HG+10nMEx-4组促增殖能力最强。 2.流式细胞术结果表明，NG，NG+Ex-4，HG及HG+Ex-4各组中，处于 S+G2/M期 DNA含量分别为11.01±0.73%，10.461±0.81%，6.45±0.15%，9.26±0.98%。HG组 S+G2/M期 DNA含量低于 NG组（P<0.005），HG+Ex-4组高于 HG组（P<0.005），NG组与 NG+Ex-4组差异无统计学意义（P＞0.05）。 3.随着成骨诱导时间增加，茜素红染色可见，矿化结节变大，变密集，染色变深。各个相同时间点，HG组所形成的矿化结节量明显低于NG组，NG+Ex-4组较NG组升高，HG+Ex-4组较HG组升高，各组差异有统计学意义（P＜0.05），NG+Ex-4组与 HG+Ex-4组相比未见明显差异（P＞0.05）。 4.RT-PCR结果显示HG组细胞内Runx2，ALP和Osx mRNA表达水平明显低于NG组，NG+Ex-4组上述基因表达水平较NG组升高， HG+Ex-4组上述基因表达水平较 HG组升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 第三部分： 1. HG组细胞内ROS水平明显高于NG组，HG+Ex-4组较HG组降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），NG组与NG+Ex-4组差异无统计学意义（P＞0.05）。 2. HG组RAGE表达水平明显高于NG组，HG+Ex-4组的RAGE基因表达水平较 HG组降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），NG组与NG+Ex-4组差异无统计学意义（P＞0.05）。 3. PDLSCs经成骨诱导后，采用ERK1/2抑制剂PD98059处理，经RT-PCR检测发现NG+Ex-4组和HG+Ex-4组成骨相关基因Runx2，ALP及Osx的表达水平相比PD98059处理前均明显升高,各组差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论： 1.高糖环境下，PDLSCs增殖及成骨分化能力显著下降。 2. Ex-4可减缓高糖对PDLSCs增殖及成骨分化能力的抑制作用。 3. Ex-4可促进正常糖浓度环境下PDLSCs成骨分化。 4.适宜浓度的 Ex-4可通过降低高糖环境下 PDLSCs内 ROS及RAGE表达水平，减缓高糖对 PDLSCs增殖及成骨分化能力的抑制，并通过调控ERK1/2信号通路促进PDLSCs成骨分化。