陆地棉农杆菌介导法共转化以及转兔角蛋白和蚕丝心蛋白基因改良纤维品质的研究

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农杆菌介导的遗传转化效率高,且T-DNA插入相对稳定,易获得目的基因稳定表达和表型正常的植株,一直是生产转基因棉花的主流技术。通过此方法获得的抗虫棉和抗除草剂棉花已在全球得到了广泛应用。抗虫棉除了单价的Bt基因之外,双价(Bt+CpT1,Bt+GNA,Bt+sck)或三价(Bt+CpT1+GNA)抗虫棉都成功地应用于改善棉花的抗虫性,拓宽了抗虫谱。抗除草剂棉花被成功推广的有抗草甘膦棉花,抗草丁膦棉花,抗2. 4-D棉花等。近年来,研究者开始将外源基因导入棉花来提高棉花的纤维品质,包括纤维强度、长度、保暖性能和纤维颜色等。 本研究将分别包含Bt+ sck双价基因、bar基因、兔角蛋白基因(keratin)和蚕丝心蛋白基因(fibroin)4个表达载体的LBA4404农杆菌工程菌株于25℃过夜悬浮培养后,菌液等摩尔混合侵染中国长江流域棉花主栽品种泗棉3号和品系WC,进行共转化的研究。得到113块胚性愈伤系,其中有82个胚性愈伤组织系形成胚状体,最终获得820株再生植株(每个胚性愈伤组织系取10株)。提取再生植株叶片的DNA,对标记基因(nptII)进行PCR扩增检测,710株阳性植株在温室嫁接,成活了566株,成活率约为80%。PCR检测和Southern杂交表明获得了不同基因组合的再生植株;以PCR结果分析了共转化的效率,结果显示,导入单个基因、两个基因、三个基因和同时导入4个基因的再生植株比例分别为48.17%、20.61%、8.29%和6.46%。同时导入两个以上载体的目的片段的共转化植株占总转化植株的35%。RT-PCR检测、卡那抗性检测、GUS组织化学检测和PPT抗性检测等表明共转化的基因在T0代得到了表达。通过共转化途径获得各种基因组合的棉花,可为不同的育种需求提供材料和技术支持。 在获得多种基因组合的共转化棉花的基础上,通过田间和室内卡那霉素抗性鉴定、田间和室内PPT抗性筛选以及对目的基因进行PCR检测,研究了不同转化事件中的各个目的基因在后代(T1和T2)的遗传和表达特点,同时对各种基因组合的株系进行了纯合选育,对于共转化材料进一步应用于育种实践具有重要的指导意义。结果证明,在获得足够种子的不同的株系中,T1植株中单个目的基因分离大都符合一对基因所表现的3:1比例(卡方值都小于X20.05,1=3.84);在淘汰了T1阴性植株后,T2代株系的单个目的基因表现为纯合或3:1的分离,说明对于单一基因来说一般以单拷贝或低拷贝插入。分别获得了单转bar基因、Bt+ sck双价基因、ker或fib基因的纯系若干,以及部分两个基因组合的纯系。对含有Bt+sck的基因进行室内接虫检测;含有bar基因抗PPT筛选;含有ker和fib基因的转基因植株进行报告基因gus表达分析,证明目的基因在后代能够遗传和表达,有望在育种实践中得到应用。 将纤维特异启动子GAE6-3A驱动兔角蛋白基因和蚕丝心蛋白基因转化陆地棉研究了它们对棉花纤维品质的影响。获得9个克隆的25个阳性单株,对这些株系后代进行PCR检测、卡那霉素检测、GUS化学组织检测分析,选育出5个的转ker基因纯合株系、4个的转fib纯系和2个的转ker+fib纯系。Southern杂交表明,外源fib和ker基因已经整合进棉花基因组中,目的基因多以单拷贝或低拷贝的形式插入。Northern杂交表明外源基因fib和ker在转基因棉花中已经稳定表达。定量PCR结果这些株系在开花后15d的纤维中目的基因表达量高低不同。对fib和ker基因进行荧光实时定量PCR分析,两个基因在0d开始表达,15-20d表达量最高,25d明显降低。这与GAE6-3A棉纤维特异表达的启动子启动的基因在15-22d优势表达是一致的。转基因棉纤维扭曲度比对照明显增加,纤维转曲的螺距越小,转曲度越大,单位长度的转曲数越多。棉纤维品质检测结果表明,与对照相比,转ker基因棉花的棉纤维的绒长变短、马克隆值增大、伸长率增加,而比强度有的增加,有的降低。转fib基因棉花对棉纤维的长度、比强度、马克隆值和伸长率也有影响。转ker+fib棉花纤维品质发生改变,株系2-1-fk主要体现在比强度增加,株系9-2-fk体现在长度变短,比强度和伸长率增加。相关性分析结果表明ker基因在15DPA的表达量和纤维螺距呈显著的负相关(r=-0.871*,p>0.05),即是ker基因的表达量越低,纤维螺距越长。转ker基因的纤维螺距和棉纤维伸长率的相关系数是-0.946** (p>0.01),呈显著负相关,即是纤维螺距越长,伸长率越小。说明ker基因在纤维中的表达使得纤维发生扭曲,纤维螺距变小,转曲数增加,进而纤维伸长率增加,长度变短,马克隆值增加。由此可见,ker和fib基因在棉纤维的特异表达可以改变棉纤维品质,为利用外源基因改善棉花品质提供理论和技术方面的证据。
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