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先天性心脏病(简称先心病)是儿童最常见的先天性畸形之一,严重影响患儿生存率以及生存质量,是新生儿早期死亡的主要原因之一。圆锥动脉干畸形是一类复杂型先心病,可以导致新生儿时期出现低氧血症和难以纠正的酸中毒,引起患儿早期死亡。因此对于圆锥动脉干畸形发病机制的研究已成为热点。研究证实,圆锥动脉干畸形是22q11微缺失综合征最常见的心脏表现,而部分圆锥动脉干畸形患者存在22q11微缺失。位于22q11微缺失关键片段的HIRA基因在动物模型中的研究发现与圆锥动脉干畸形有关。然而,尽管22q11微缺失综合征患者普遍表现有圆锥动脉干畸形,但是对于单纯圆锥动脉干畸形与22q11微缺失的研究结果并不一致,此外,在人类圆锥动脉干畸形与22q11微缺失片段上的相关基因的研究还非常有限。本课题拟研究法洛四联症患儿HIRA基因启动子区的基因序列、HIRA基因在右室流出道心肌组织中的mRNA和蛋白水平表达以及启动子区甲基化状态,探讨HIRA基因与法洛四联症的关系,为深入研究以法洛四联症为代表的圆锥动脉干畸形的发生机制提供实验依据和立论基础。第一部分法洛四联症患儿HIRA基因启动子区序列分析目的：观察法洛四联症患儿HIRA基因启动子区的序列变化。方法：应用PCR技术以及测序方法,选取100例法洛四联症患儿、200例心脏结构正常的健康儿童的外周血,对HIRA基因第一外显子上游1000bp左右的碱基序列进行测序,分析HIRA基因启动子区碱基序列改变与法洛四联症的关系。结果：检测HIRA基因启动子区,在病例组中发现有4个杂合突变位点,分别为-574G>GA、-552G>GC、-305A>AG和-137C>CT,这4个杂合突变各出现在1例法洛四联症患儿中,200例正常对照组中并未发现,其中-137位点上结合有转录因子CP2。在启动子区还存在5种SNP,其中-630C>CA在UCSC数据库中未查到,可能为中国人群特有的多态位点,其等位基因和基因型分布在病例组和对照组间无统计学差异。另外4个SNP分别是-890A>AG(rs1128399)、-736C>CA(rs4585115)、-632T>TG(rs2277837)和-458T>TC(rs111802956),其等位基因和基因型分布在病例组与正常对照组间亦均无统计学差异,其中-458位点结合有转录因子GATA-1、GATA-2和GATA-3。小结：1.法洛四联症患儿HIRA基因启动子区存在的可能的突变位点包括：-574G>GA、-552G>GC、-305A>AG和-137C>CT; SNP位点包括：-890A>AG>-736C>CA、-632T>TG、-630C>CA和-458T>TC。2.法洛四联症患儿HIRA基因启动子区-137位点杂合突变(C>CT)及-458位点SNP(T>TC)可能会影响其相应位点的转录因子：CP2(-137位点)和GATA-1、 GATA-2、GATA-3(-458位点),在转录水平影响HIRA基因的表达。第二部分法洛四联症患儿心肌组织中1HIRA基因表达水平的初步研究目的：观察HIRA基因在法洛四联症患儿心肌组织中表达水平。方法：选取39例法洛四联症患儿右室流出道部位心肌组织,应用real-time PCR方法检测HIRA基因在mRNA水平的表达；其中12例样本,应用免疫组化的方法检测HIRA基因在蛋白水平的表达。结果：1.HIRA基因mRNA在法洛四联症患儿心肌组织中表达明显低于对照组。2. HIRA基因蛋白水平在法洛四联症患儿心肌组织中表达明显低于对照组。小结：1.法洛四联症患儿心肌组织中HIRA基因的异常低表达,提示其可能参与了法洛四联症的发病机制。2.法洛四联症患儿心肌组织中HIRA基因在mRNA和蛋白水平的低表达提示存在转录水平的异常调控。第三部分法洛四联症患儿心肌组织中HIRA基因甲基化水平的初步研究目的：观察HIRA基因在法洛四联症患儿心肌组织中的甲基化水平,探讨其与该基因低表达的关系。方法：选取12例法洛四联症患儿右室流出道部位心肌组织作为研究对象,通过亚硫酸氢盐测序方法(bisulfite-PCR, BSP)观察HIRA基因启动子区在法洛四联症患儿心肌组织中甲基化水平变化。结果：本研究中HIRA基因启动子区甲基化程度在TOF组与正常对照组中均呈现整体低甲基化状态(整体甲基化百分率<5%),组间整体及各CpG位点甲基化程度均无明显统计学差异,且各样本甲基化程度与其相对应的mRNA、蛋白水平的表达无明显相关性。小结：法洛四联症患儿心肌组织中HIRA基因的低表达可能与该基因启动子区甲基化水平无关,可能受到其它调控因素的影响。