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山豆根是一味传统的中药材，近年来有关其不良反应的报道也逐渐增多，尤其是很多临床前报道大剂量使用下的肝损伤问题。日前，由于对山豆根致肝损伤的成分及机制了解不明确导致研究中存在诸多矛盾。本课题在前期研究的基础上利用乙醇和二氯甲烷对山豆根水提液进一步分离制备得到醇沉和二氯甲烷两个部位，通过大鼠实验研究其对肝脏潜在的毒性作用;并应用代谢组学轮廓分析观察给药后大鼠血清代谢谱的变化，胆汁酸靶向检测分析血清中16种胆汁酸的改变，以期在充分发挥其疗效的同时尽可能避免其毒性风险，为山豆根的临床合理应用提供参考依据。 方法： 1.山豆根二氯甲烷和醇沉部位的分离制备及主要成分的含量测定 采用萃取分离的方法将山豆根水煎液分为二氯甲烷(DCM)和醇沉(ET)两个部位。并将此工艺进行中试，为后期动物给药提供受试物。随后，我们采用正交设计建立紫外分光光度法分别测定DCM和ET两个部位的总生物碱和总多糖的含量。建立HPLC分析方法，在检测波长210nm处对这两个部位的苦参碱(MT)和氧化苦参碱(OMT)进行含量测定研究。 2.山豆根二氯甲烷和醇沉部位的毒性实验研究 采用急性毒性实验方法测定山豆根DCM部位对昆明种小鼠的口服半数致死量(LD50)，统计累计死亡数，计算LD50。取山豆根ET部位对昆明种小鼠进行最大耐受量(MTD)实验，记录死亡情况。随后，我们将Wistar大鼠分为Control组、山豆根二氯甲烷部位低(DCM-Low)、中(DCM-medium)、高（DCM-high）剂量组、山豆根醇沉部位低(ET-Low)、中(ET-medium)、高(ET-high)剂量组以及全组分组(Full)8个组别，每组10只，雌雄各半。连续给药7、14、28天后取斑、取材。计算肝脏指数，脏脑比。采用全自动生化仪测定各取样时间点血清样本的ALT、AST、ALP、TBA、TBiL及GLDH的含量。对各处理时间点的肝脏样本切片进行HE染色，光镜下观察肝脏组织病理学改变。 3.山豆根二氯甲烷和醇沉部位大鼠重复给药血清代谢组学研究 研究采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分别对不同时间和不同剂量给药大鼠血清进行代谢组学研究。不同剂量组包括:14天control、DCM-low、DCM-medium、DCM-high、ET-high和Full共6组。不同时间组别包括:7、14、28天的control、DCM-medium、ET-medium、Full共12组。采集代谢物信息，运用主成分分析法(PCA)筛选毒性明显的组别，结合偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)寻找差异代谢物。通过搜索数据库构建相关代谢通路，深入挖掘并探讨山豆根ET和DCM两个部位对大鼠肝脏毒性可能的机制。 4.山豆根二氯甲烷和醇沉部位大鼠重复给药的血清胆汁酸靶向代谢组学研究 将大鼠血清根据研究目的分为14天control、DCM-low、DCM-medium、DCM-high、ET-high、Full，6组不同剂量组和7、14、28天的control、DCM-high、ET-high、Full，12组不同时间组。采用UPLC-QQQ-MS技术对各组大鼠血清中的16种胆汁酸进行精准鉴别及含量测定，并通过多元统计分析找到潜在的差异胆汁酸。 结果： 1.山豆根二氯甲烷和醇沉部位的分离制备及主要成分的含量测定 山豆根饮片进行一系列的分离提取得到浸膏粉4.67kg，醇沉部位5.325kg，二氯甲烷部位2.383kg，提取率分别为为20.8％、7.9％和0.57％。采用紫外分光光度法测定ET部位的总生物碱的含量为11.2％，总多糖的含量为45.67％。DCM部位中总生物碱的含量为86.5％，未检测到总多糖含量。210nm检测波长下测得DCM部位的MT和OMT的含量分别为54.84％和22.20％，ET部位的MT和OMT的含量分别为1.47％和1.98％。 2.山豆根二氯甲烷和醇沉部位的毒性实验研究 山豆根DCM部位对小鼠的LD50为0.75g/kg，95％可信限为0.647-0.918g/kg。单次给予高剂量的山豆根ET部位，最大耐受量为16g/kg/d。多次灌胃山豆根DCM和ET部位后，大鼠体重、摄食量和血清ALT和TBiL都有较明显的变化。DCM-high、ET-high以及Full与control组相比有统计学差异(P＜0.05)。提示我们在大剂量、长时间给药的情况下山豆根DCM、ET和Full组对大鼠肝脏可能具有一定的毒性作用。 3.山豆根二氯甲烷和醇沉部位大鼠重复给药血清代谢组学研究 多元统计分析发现给药引起了大鼠血清代谢轮廓的变化，结合t检验找到了引起差异的潜在代谢物，不同剂量多次给药后下调的代谢物有柠檬酸、a-酮戊二酸和苹果酸，上调的代谢物有胆酸，脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、马尿酸和溶血性卵磷脂。不同时间多次给药后下调的代谢物有柠檬酸、a-酮戊二酸，上调的有胆酸，脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、马尿酸和溶血性卵磷脂。差异皆具有统计学意义(P＜0.05)。 4.山豆根二氯甲烷和醇沉部位大鼠重复给药的血清胆汁酸靶向代谢组学研究 山豆根DCM和ET部位不同时间和剂量给药对大鼠血清中16种胆汁酸具有一定的扰动作用，多元统计分析结合t检验发现CA、DCA、LCA、THDCA受到山豆根DCM和ET部位给药后造成的影响较大，提示这些胆汁酸可能作为表征山豆根DCM和ET部位致大鼠肝损伤风险的潜在标志物。 结论： 本课题分离制备了山豆根DCM和ET这两个部位，并初步鉴定这两个部位中的主要成分含量分别为生物碱和多糖。通过动物给药发现这两个部位在长期大剂量下对大鼠肝脏均有潜在的毒性风险，利用代谢组学初步探索了这两个部位给药后代谢通路的变化，发现其毒性可能与胆汁酸、氨基酸代谢有关。对16种胆汁酸进行靶向代谢组学研究，找到可能与毒性相关的4个潜在的差异胆汁酸。