【摘 要】
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青霉素G酰化酶是半合成抗生素生产中的关键酶。粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶(Alcaligenes faecalis，Af-PGA)因其具有独特的优点而受到广泛关注。本论文主要以Af-PGA如何有效
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青霉素G酰化酶是半合成抗生素生产中的关键酶。粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶(Alcaligenes faecalis，Af-PGA)因其具有独特的优点而受到广泛关注。本论文主要以Af-PGA如何有效应用于工业生产为研究对象，考察其提纯、固定化及毕赤酵母中表达，主要做了以下三个部分的工作：
第一部分，以重组菌DH5α/pSMLPGA为研究对象，比较了不同的Af-PGA提取方法，发现乙酸丁酯渗透提取法比传统提取纯化法操作简单、成本低廉。通过优化得到了乙酸丁酯渗透处理的最优条件为：5％(v/v)乙酸丁酯，温度25℃，时间36 h。Af-PGA的提取率达到93.78％，获得酶液的比活为14.45 U/mg蛋白。
第二部分，以氨基和环氧基载体作为固定化的载体材料，按照实验室原先优化的固定化条件，将经乙酸丁酯渗透提取获得的酶液进行固定化，发现乙酸丁酯的残留影响了氨基载体对Af-PGA的固定化效果，比对照低12％左右。采用活性炭吸附和超滤处理均能有效地去除酶液中乙酸丁酯的残留，使其浓度低至0.010％。优化了活性炭吸附法的条件，最终确定处理时间3 h，活性炭浓度8％。经过以上处理去除乙酸丁酯的Af-PGA酶液再次与氨基载体固定化，取得了较为理想的结果。
第三部分，以大肠杆菌DH5α/pSMLFPGA菌落为模板，进行PCR扩增获得Af-PGA目的基因片段，连接到毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA和pGAPZαA中，并电转化同源重组到毕赤酵母X33基因组中，抗生素平板筛选获得了分泌型表达的甲醇诱导型菌株X33/pPICZαA-Af-PGA和非甲醇诱导型菌株X33/pGAPZαA-Af-PGA。但在后期诱导表达及鉴定中，两种酵母菌株发酵上清液中Af-PGA的含量很低，分析了造成此种现象可能的原因。
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