抗皮肤癣菌卵黄抗体的制备及其生物活性研究

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皮肤癣菌是一类侵犯人体角蛋白组织的丝状真菌,能感染人体皮肤、指(趾)甲、和毛发等而引起皮肤癣菌病,还可以引起脓癣、脓肿和肉芽肿等皮肤深部感染。目前,皮肤癣菌病主要采用广谱抗生素,激光进行治疗。此外,还有一些从植物中提取的抑菌成分。然而,随着真菌感染率的不断升高,对现有抗真菌药物的耐药性日趋严重,并且治疗周期长、见效慢、病情反复,给个人、家庭甚至社会都带来沉重的负担。因此,研发出安全、高效的抗菌制剂以解决市场需要变得尤为迫切。  卵黄抗体(IgY)具有制备简单、经济安全、稳定性强等优点,且特异性IgY有预防和治疗疾病的功效。鉴于其拥有独特的免疫化学性质,近年来IgY在医药卫生上有了广泛的研究和应用。因此,特异性IgY的研究可能为皮肤癣菌病的治疗提供了一个新思路。然而,截止目前,据我们所知,有关抗皮肤癣菌的IgY研究报道很少。  本文主要研究了红色毛癣菌(tr)和须癣毛癣菌(tm)两种皮肤癣菌。分别提取了其胞浆蛋白(CP)和细胞壁蛋白(CWP),以提取的蛋白作为抗原免疫产蛋母鸡,经PEG两步沉淀法和饱和硫酸铵盐析法提纯特异性IgY。用考马斯亮蓝G-250法测定其蛋白含量;SDS-PAGE凝胶电泳分析测定IgY的纯度以及相对分子质量;ELISA检测IgY的效价;Western blot和间接荧光抗体试验分析特异性IgY的免疫反应性;采用微量稀释法研究IgY的体外抑菌活性,并建立皮肤癣菌感染的BALB/c小鼠模型评价IgY的疗效。  结果表明:采用细胞裂解的方法提取的两种皮肤癣菌的胞浆蛋白种类较多;采用冷碱抽提的方法提取的细胞壁蛋白杂质较少,条带清晰。采用饱和硫酸铵溶液纯化IgY,纯度均达到90%以上。根据ELISA结果,IgY初免后约20天效价逐渐升高,38天左右IgY的效价达到了最高值(抗trCP IgY的效价最高达到1:32000,抗trCWP IgY的效价最高达到1:16000,抗tmCP的IgY效价最高达到1:16000,抗tmCWP的IgY效价最高达到1:32000)。最高效价持续时间为30-40天。免疫印迹和间接荧光检测结果显示,IgY与对应的皮肤癣菌蛋白发生特异性结合。体外抑菌实验表明,随着IgY浓度的增加,抗CWP的IgY能一定程度的抑制皮肤癣菌的生长,而抗CP的IgY对于皮肤癣菌的生长几乎没有影响。感染小鼠的皮损评分和组织病理学分析结果显示,与阴性组对照,抗CWP的特异性IgY高剂量组(20 mg/mL)、中剂量组(10 mg/mL)和低剂量组(5 mg/mL)均不同程度的缓解皮肤癣的病症,并随着剂量的增加,疗效增强。抑菌活性检测和治疗效果的评价,为特异性IgY在皮肤癣菌病的预防和治疗的应用研发上奠定了理论基础。
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