论文部分内容阅读
核苷酸还原酶(ribonucleotide reductases，RNR)是生物体内脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleotide triphosphates，dNTPs)从头合成途径中的关键限速酶，与DNA复制和修复紧密联系，对于细胞的增殖、分化和癌变具有重要意义。RNR全酶是由大亚基和小亚基(或者调节亚基和催化亚基)组成的异源四聚体。哺乳动物存在3个RNR基因：RRM1编码调节亚基R1，RRM2和RRM2b编码催化亚基R2和p53R2，它们不仅可以通过全酶形式发挥作用，还能够以单体形式通过未知机制独立发挥作用。作为肿瘤治疗或者遗传毒性监测的靶分子和生物指示物，RNR日益受到重视。然而，迄今在动物模型中研究RNR的报道比较少，RNR在模式鱼类中的表达及其生理功能尚不清楚。在本研究中，我们在胚胎整体水平研究了斑马鱼或者青鳉的RRM1，RRM2和RRM2b的表达特征与调控机制。
我们鉴定了一个编码RNR大亚基的返座基因RRM1b(产物为R1b)。通过比较基因组学和分子生物学方法，分析并研究了它的进化、表达和转录调控特征。RRM1b的蛋白序列与其亲本拷贝RRM1a高度相似，在进化过程中受到强烈的纯化选择，RRM1b丢失了RRM1a中间15个内含子，RRM1b利用与其呈“头对头”排列的邻座基因启动子进行转录表达，具有与其亲本拷贝相似的时空表达特征，但是在性腺组织和早期发育的胚胎中，RRM1b的转录本丰度高于RRM1a。我们的结果还提示，在RRM1b残存的内含子中可能含有使其保留亲本拷贝转录特征的重要调控序列。总之，这些结果表明RRM1b是鱼类一个世系特异的具有重要功能的RNR返座基因。
我们揭示了可变启动子、可变剪接和可变多聚腺苷酸化在转录和转录后水平参与调控斑马鱼RRM2(产物为R2)的表达。我们鉴定了3个独立的启动子，它们能够产生6个转录本。近端启动子主要负责RRM2的细胞周期性转录，E2F结合位点和CCAAT框对这一效应具有重要意义。此外，远端启动子的转录活性能够被DNA损伤信号诱导。序列分析发现，由于可变剪接，受DNA损伤诱导的两个转录本可以编码2个氨基端截短的R2异构体，它们均含有完整的对于催化活性具有重要意义的残基，但丢失了介导小鼠R2在M期多聚泛素化降解的KEN基序。体外实验显示，它们和常见形式的R2一样，主要定位在细胞质，而且均能够和R1相互作用。总之，多层次的调控机制使斑马鱼RRM2能够在S期和DNA损伤应激时特异性表达并行使潜在功能。
我们鉴定了斑马鱼RRM2b(产物为p53R2)，它的蛋白序列与人p53R2有72.8％序列相似性，许多重要的氨基酸残基均非常保守。RRM2b广泛表达于各个发育时期和成体组织中。我们鉴定了一段长250 bp的含有核心启动子的调控区域，它能够以不依赖p53的方式启动RRM2b的本底转录。斑马鱼RRM2b的表达能够被DNA损伤试剂CPT或MMS诱导，这种诱导效应是p53依赖的。而且在应对DNA损伤应激时，p53R2和正常状态下一样主要定位在细胞质中，最后，我们发现过表达p53R2能够抑制胚胎中由DNA损伤引起的细胞凋亡。我们的结果提示，p53R2同源物的序列、表达及其调控特征和生理功能在斑马鱼中均是保守的。