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目的:放射性肺损伤是胸部肿瘤放疗最常见的并发症,既往关于其发生机制的研究主要集中在氧自由基及炎性细胞因子的产生和效应,而放射性肺损伤后发生上皮间质转化(EMT)的现象及其机理并未引起足够的重视。近期有多项研究表明,复方苦参注射液对上皮间质转化有一定的抑制作用。本项目拟通过建立小鼠放射性肺损伤疾病模型,以不同浓度复方苦参注射液进行干预,而后评估小鼠肺损伤程度,测定EMT相关的表型标记物、细胞因子等变化,以及EMT相关信使mRNA转录水平变化及由此导致TGF-β1/Smads、Wnt/β-catenin信号通路交互变化。本项目拟通过观察复方苦参注射液对放射性肺损伤小鼠上皮间质转化效应途径的影响,有望阐明复方苦参注射液通过抑制上皮间质转化而防治放射性肺损伤的机理,为临床推广使用复方苦参注射液防治放射性肺损伤提供实验依据。方法:1.理论部分:通过回顾性分析了中医学对放射性肺损伤的认识,探究了热毒络瘀相关理论的源流及其典型代表中成药复方苦参注射液。2.实验部分:C57bl/6小鼠194只,雄性,依据随机数字表法分为10组:空白对照组(Control group,Control)、模型组(Model group,Model)、复方苦参注射液低剂量组(Compound kushen injection-Low dose group,CKI-L)、复方苦参注射液中剂量组(Compound kushen injection-Middle dose group,CKI-M)、复方苦参注射液高剂量组(Compound kushen injection-High dose group,CKI-H)、信号通路激动剂1组(SB431542,SB)、信号通路抑制剂2组(XAV-939,XAV)、复方苦参注射液+信号通路抑制剂1组(CKI+SB)、复方苦参注射液+信号通路抑制剂2组(CKI+XAV)、地塞米松注射液组(Dexamethason,DXM)。使用美国XStrahl小动物精准放疗辐照研究平台(SARRP),实施单次20 Gy双侧肺野照射成功建立C57bl/6小鼠放射性肺损伤模型。照射后观察小鼠的一般情况,分别于照射后第2、4、6、8、10、12周6个时间点处死小鼠,采集血清和取出肺组织。取第4、8周C57bl/6小鼠肺组织,小鼠及肺组织称重,计算肺系数,采用苏木精伊红染色法(HE)和Masson染色,分别通过光学显微镜和电子显微镜观察各组C57bl/6小鼠肺组织病理学形态改变;采用免疫组织化学染色法(IHC)检测C57bl/6小鼠在第4周、第8周的肺组织中E-cadherin、Vimentin蛋白表达情况;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测C57bl/6小鼠在第第4周、第8周采集血浆中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和转化生长因子β1(TGF-β1)含量;采用实时定量PCR法(RT-qPCR)检测各组小鼠第4周、第8周肺组织中TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA、GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA的表达水平;采用免疫印迹法(Western-blot)分别检测各组小鼠在第4周、第8周肺组织内TGF-β1、Smad3、GSK-3β、β-catenin通道蛋白表达水平。结果:1.实验一结果复方苦参注射液可增加放射性肺损伤小鼠肺系数,减轻小鼠放射性肺损伤病理损害程度,并可改善小鼠一般情况,包括毛色、脱毛、食量、活动及体重等。2.实验二结果2.1 HE染色结果:Control组:小鼠肺组织肺泡壁较薄,肺泡结构清晰,毛细血管完整,无充血及水肿,无炎症细胞浸润,各时间点均未见明显病理改变;Model组:照射后前2周以渗出性病变为主,肺泡腔可见少量炎症细胞浸润,出现急性肺间质水肿、充血,第4周可见肺组织间质明显水肿及支气管周围炎性细胞浸润,肺泡结构破坏,部分肺泡萎缩,第6周炎性细胞浸润减少,小鼠肺组织间质水肿渐渐消退,肺泡隔渐增宽,肺泡腔有所缩小,出现成纤维细胞,胶原增生,第8周小鼠炎性细胞减退,肺组织间质水肿进一步消退,肺泡间隔增宽,肺泡结构破坏,出现部分肺泡塌陷伴有不张,还可见少许梭形成纤维细胞,第12周小鼠肺泡扩张加重,胶原增生明显,气体交换空间显著减少,肺泡塌陷更明显、并纤维化;CKI-L组、CKI-M组及CKI-H组:第2周渗出性病变较轻,肺间质水肿、充血及炎性细胞浸润程度等均较Model明显减轻;第4周,可见少许炎性细胞浸润,肺组织间质轻度水肿;第8周可见炎性渗出,肺泡壁毛细血管轻度充血,肺间质轻度水肿,肺泡部分塌陷,肺泡壁略有增厚,但是上述表现均较Model组明显减轻;第12周可见少许成纤维细胞,肺泡壁轻度增厚,部分肺纤维化,但均明显较Model组显著减轻;DXM组各时间点与CKI-H组无明显差别;SB组和XAV组各时间点处于CKI-M组及CKI-H组之间,但未见明显差别;CKI+SB组和CKI+XAV组第2周、第4周渗出性病变较轻微,肺间质水肿、充血及炎性细胞浸润程度等均较单药干预组明显减轻;第8周可见少许炎性渗出,肺泡壁毛细血管轻度充血,肺间质轻度水肿,肺泡部分塌陷,肺泡壁略有增厚,但是上述表现均较单药干预组明显减轻;第12周可见少许成纤维细胞,肺泡壁轻度增厚,部分肺纤维化,但均明显较单药干预组显著减轻。2.2 Masson染色结果:胶原纤维呈蓝色,肌纤维呈红色,细胞核呈现蓝黑色。Control组:胶原纤维较少,肌纤维多,细胞核多;Model组:随着造模时间的延长,胶原纤维逐渐增多,可见大量胶原纤维;与Model组比较,复方苦参注射液各浓度组的胶原纤维染色受到较为明显的抑制;SB组、XAV-939组胶原纤维染色也受到较为明显的抑制,胶原纤维量较模型组明显减少,与CKI-M组和CKI-H组相仿;SB组、XAV组,各时间点胶原纤维量较Model组明显减少,与单药干预组相比,胶原纤维染色受到更为明显的抑制。放射性肺炎和放射性肺纤维化常常同时发生,随着时间进一步延长,放射性肺炎逐步减轻和放射性肺纤维化程度渐渐加重,本研究4周内以放射性肺炎为主,4周到8周出现放射性肺炎渐减轻和放射性肺纤维化程度渐加重,12周以放射性肺纤维化为主,经过复方苦参注射液及信号通路抑制剂单药或联合干预后,放射性肺炎及放射性肺纤维化程度受到明显的抑制,CKI-M组和CKI-H组干预效果优于CKI-L组,与信号通路抑制剂组相当,逊于CKI+SB组、CKI+XAV组。2.3透射电镜结果:Control组:细胞核大,呈现椭圆形,未见胶原纤维,结构完整,肺泡腔相对干净,肺泡间隔未增宽增厚,肺泡上皮细胞表面绒毛球形,高尔基体数量较多,偶见巨噬细胞和红细胞;Model组:细胞核固缩,变小,可见大量胶原纤维,可见条索样改变,肺泡上皮细胞线粒体肿胀明显,其内部活性物质增多较多,胞浆减少,空泡较为严重,巨细细胞增多,伴有纤维细胞产生;复方苦参注射液各浓度组:各时间点细胞核大小介于Control组和Model组之间,胶原纤维数目中等,肺泡上皮细胞线粒体肿胀较轻,处于慢性炎症修复阶段。SB组及XAV组:各时间点细胞核大小介于Control组和Model组之间,胶原纤维数目与CKI-H组及CKI-H组相当。CKI+SB组、CKI+XAV组两联合用药组:各时间点细胞核大小介于Control组和Model组之间,胶原纤维数目较单药干预组明显减少,肺泡上皮细胞线粒体肿胀也较单药干预组明显减轻,处于慢性炎症修复阶段。3.实验三结果3.1各组小鼠肺组织中E-cadheren蛋白表达情况:E-cadheren蛋白主要表达定位于细胞膜、细胞浆液和细胞连接等。免疫组化结果显示:E-cadheren蛋白在肺组织细胞浆和胞膜上表现为棕黄色或棕褐色或淡黄色颗粒。Control组小鼠肺组织中的E-cadheren表达率较高;Model小鼠肺组织中的E-cadheren表达率很低;复方苦参注射液各剂量组C57bl/6小鼠肺组织各时间点的E-cadheren表达率介于Control组和Model组之间,E-cadheren表达率处于中等;SB组及XAV组小鼠肺组织各时间点的E-cadheren表达率也同样介于Control组和Model组之间,E-cadheren表达率与CKI-M组及CKI-H组相当;CKI+SB组、CKI+XAV组两联合用药组小鼠肺组织各时间点的E-cadheren表达率虽然介于Control组和Model组之间,但E-cadheren表达率较单药干预组明显增加,更接近于Control组。3.2各组小鼠肺组织中Vimentin蛋白表达情况:Vimentin蛋白主要表达在定位于细胞浆,常附在细胞核、内质网及线粒体的旁边或末端。免疫组化结果显示:Vimentin蛋白在肺组织细胞浆上表现为棕黄色或棕褐色或淡黄色颗粒。Control小鼠肺组织中的Vimentin表达率很低;Model组小鼠肺组织中的Vimentin表达率较高;复方苦参注射液各剂量组小鼠肺组织各时间点的Vimentin表达率介于Control组和Model组之间,Vimentin表达率处于中等;SB组及XAV组小鼠肺组织各时间点的Vimentin表达率也同样介于Control组和Model组之间,Vimentin表达率与CKI-M组、CKI-H相当;CKI+SB组、CKI+XAV组小鼠肺组织各时间点的Vimentin表达率虽然介于Control组和Model组之间,但Vimentin表达率较单药干预组明显减少。4.实验四结果与Control组比较,Model组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第4、8周均显著性升高(P<0.01);与Model组比较,除CKI-L组第8周外,CKI-M组、CKI-H组及其他用药干预组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第4、8周均显著性降低(P<0.05,P<0.01);与CKI-M组比较,CKI+SB组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第8周均显著性降低(P<0.05,P<0.01),CKI+SB组、CKI+XAV组小鼠血清TNF-α含量在第4周均显著性降低(P<0.05),CKI-L组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第4周显著性升高(P<0.05),其余各用药干预组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第4、8周均未见显著性差异(P>0.05);与CKI-H组比较,CKI-L组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第4周均显著性升高(P<0.05,P<0.01),CKI-L组小鼠血清TGF-β1含量在第8周均显著性升高(P<0.05,P<0.01),CKI+SB组小鼠血清TGF-β1含量在第4周显著性降低(P<0.05,P<0.01),CKI+SB组小鼠血清TNF-α含量在第8周显著性降低(P<0.05),其余各用药干预组小鼠血清TGF-β1含量在第4、8周均未见显著性差异(~△P>0.05);与DXM组比较,CKI-L组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第4周均显著性升高(P<0.05,P<0.01),CKI-L组小鼠血清TGF-β1含量在第8周均显著性升高(P<0.05,P<0.01),CKI+SB组小鼠血清TGF-β1含量在第4周显著性降低(P<0.05),其余各用药干预组小鼠血清TGF-β1含量在第4、8周均未见显著性差异(P>0.05)。5.实验五结果5.1 Real time RT-PCR实验结果:与Control组比较,Model组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平明显升高(P<0.01);与Model组比较,CKI-L组、CKI-M组、CKI-H组、DXM组、CKI+SB组、CKI+XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平均有不同程度降低(P<0.01,P<0.05);与CKI-H组比较,DXM组、SB组、XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平变化改变不明显(P>0.05),CKI-L组、CKI-M组第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平变化改变不明显(P>0.05),而CKI+SB组、CKI+XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平改变明显,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);而CKI-L组、CKI-M组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平改变明显,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与DXM组比较,CKI-H组、SB组、XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平变化不明显(P>0.05),CKI+SB组、CKI+XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平改变明显,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01),而CKI-L组、CKI-M组第四周TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平变化不明显(P>0.05)。5.2 Western t bolt实验结果:与Control组比较,Model组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与Model组比较,CKI-H组、DXM组、CKI+SB组、CKI+XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平均有不同程度降低(P<0.01,P<0.05),而CKI-L组和CKI-M组TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平变化改变不明显(P>0.05);与CKI-H组比较,CKI-L组、CKI-M组、DXM组、SB组、XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平变化改变不明显(P>0.05),而CKI+SB组、CKI+XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平改变明显,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与DXM组比较,CKI-L组、CKI-M组、CKI-H组、SB组、XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平变化不明显(P>0.05),CKI+SB组、CKI+XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平改变明显,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。5.3免疫荧光实验结果:TGF-β1蛋白主要表达在细胞间质。Smad3蛋白主要表达在定位于细胞核及细胞浆。GSK-3β蛋白主要表达在定位于细胞核、细胞浆及细胞膜。β-catenin蛋白主要表达在定位于细胞核、细胞浆及细胞膜。TGF-β1蛋白免疫荧光结果显示:TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白在肺组织细胞间质为深浅不同的红色颗粒。Control组C57bl/6小鼠肺组织中的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β表达率很低;Model组C57bl/6小鼠肺组织中的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β表达率较高;复方苦参注射液各剂量组C57bl/6小鼠肺组织各时间点的TGF-β1表达率介于Control组和Model组之间,TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β表达率处于中等;信号通路抑制剂SB431542组及XAV-939组C57bl/6小鼠肺组织各时间点的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β表达率也同样介于Control组和Model组之间,TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β表达率与CKI-M组和CKI-H组相当;复方苦参注射液+SB431542组、复方苦参注射液+XAV-939组两联合用药组C57bl/6小鼠肺组织各时间点的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β表达率虽然介于Control组和Model组之间,但TGF-β1表达率较单药干预组明显减少。结论:放射性肺损伤发病机制复杂,近年来放射性肺损伤后发生的上皮间质转化备受关注。为此,我们基于上皮间质转化及中医热毒络瘀理论,选择中成药复方苦参注射液来干预小鼠放射性肺损伤,并取得了较好的放射防护作用,其可能机制如下:1.复方苦参注射液可以通过降低血清中EMT相关的TNF-α和TGF-β1的水平,从而减轻C57bl/6小鼠放射性肺损伤;2.复方苦参注射液可以降低TGF-β/Smads和Wnt/β-catenin信号通路EMT相关基因的表达;3.复方苦参注射液还可通过降低TGF-β/Smads和Wnt/β-catenin信号通路EMT相关通道蛋白的表达来达到防治放射性肺损伤的目的。