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嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus，简称A.caldus)是一种化能自养细菌，能够氧化元素硫和各种还原性的无机硫化合物，并从中获得能量和还原力，以此来完成自身的生长代谢。A.caldus是生物冶金工业中常见的应用菌株，其生长的最适pH和最适温度分别为1.5-2.5和40-50℃。A.caldus体内存在一套复杂而又高效的无机硫化合物的代谢系统。其中，硫代硫酸盐又是在整个硫代谢系统中重要的中间代谢物，它能够通过连四硫酸盐介导的硫代硫酸盐代谢途径(S4I pathway)进行代谢。因此，揭示S4I途径的作用和调控机制，对于深入了解A.caldus整个硫代谢系统，以及相关的调控机制，具有重要的的理论指导意义。 S4I途径中包含有两种酶:硫代硫酸盐泛醌氧化还原酶(Tqo或DoxDA)和连四硫酸盐水解酶(TetH)。这两种酶的编码基因位于同一个基因簇上(tetH基因簇)。通过生物信息学发现，在tetH基因簇上，tetH基因前还存在rsrR和rsrS两个基因，编码一套双组分的调控系统。因此，结合A.caldus在单质硫培养过程硫代谢相关基因及一些调控基因的明显的变化规律，推断双组分调控系统RsrS-RsrR极有可能调控S4I途径。 本论文即针对上述要解决的问题，从以下几个方面开展了研究工作: 一、A.caldus中培养过程的全基因组表达谱分析 A.caldus在单质硫为能源的培养过程中，随着单质硫的活化氧化，产生各种可代谢的硫化合物，进而开启相关代谢途径。为了阐释在单质硫培养过程中，各种硫代谢途径及其相关调控基因在整个过程中的转录变化情况，利用全基因组芯片对单质硫培养过程（2天、4天、6天8天和10天）进行了系统的转录组分析，结果表明A.caldus的硫代谢相关基因及一些调控基因具有明显的变化规律，为系统研究硫代谢的调控机制提供了思路和线索，为从整体上认识理解硫代谢的调控网络奠定了基础。在分析部分调控基因的过程转录情况时，发现分别有两套双组分调控系统可能与硫代谢相关，其中，双组分调控系统RsrS-RsrR可能调控A.caldus的S4I途径。 二、使用无痕敲除技术进行双组分调控系统RsrS-RsrR编码基因的无痕敲除 本文基于同源重组的原理，使用无痕敲除技术，分别通过构建自杀质粒pSDUDI∷rsrR(UHA+ DHA)和pSDUDI∷rsrS(UHA+DHA)，经过接合转移操作，使用同源臂内测引物、外侧基因和基因内部引物筛选验证，成功获得了rsrR和rsrS基因的敲除株。敲除株的获得，对于研究双组分调控系统RsrS-RsrR的功能是最基本而又最重要的步骤。 三、△rsrR、ArsrS生长曲线分析 在获得△rsrR、△rsrS敲除株后，分别检测了其在以硫粉或连四硫酸盐作为底物能源时的生长状况，分析了与野生型的生长差异。结果在硫粉培养时，两个敲除株相对于野生型没有表现出明显的差异。然而，在连四硫酸盐培养时，分别表现出了2天和4天的生长延迟。另外，针对这两个敲除株构建的回补菌株的生长曲线，表明在被敲除的基因得到回补后，生长曲线又恢复到与野生型一致。这一结果对于分析和推断rsrR、rsrS基因在硫代谢调控，尤其是S4I途径中的作用具有重要意义。 四、连四硫酸盐刺激时A.caldus中tetH基因簇基因表达研究 S4I途径是目前硫氧化细菌中唯一明确的能够代谢连四硫酸盐的途径，而RsrS-RsrR双组分调控系统又极有可能调控该途径。因此，在使用硫粉培养A.caldus时，通过加入连四硫酸盐刺激，使用RT-qPCR检测tetH基因簇中基因的转录变化情况。结果野生型的tetH基因簇中的基因在连四硫酸盐刺激后均发生了明显的表达上调;而ArsrR、△rsrS敲除株，由于双组分调控系统的缺失，使得调控途径中断，导致tetH基因簇中的基因在连四硫酸盐刺激后并没有出现明显的表达变化。从而可以推断和初步验证RsrS-RsrR双组分调控系统对于S4I途径的正向调控功能。 五、A.caldus中tetH基因簇的分析研究 在喜温硫杆菌中，S4I途径是硫代谢系统的重要组成部分，该途径包含的连四硫酸盐水解酶(TetH)和硫代硫酸盐泛醌氧化还原酶(DoxDA)，在多种硫氧化微生物中都存在。对喜温硫杆菌属和其他硫氧化细菌，甚至含有相似代谢途径的古菌进行分析，发现喜温硫杆菌在tetH和doxDA基因前独特的进化出了一套RsrS-RsrR双组分调控系统的编码基因。这对于更有序高效的调控复杂的硫氧化系统是有利且必须的。 另一方面，通过生物信息学分析喜温硫杆菌中tetH基因簇的启动子情况。并通过构建探测质粒进行外源测GusA酶活，内源RT-qPCR技术检测gusA基因转录等方式，验证了可能的启动子。而且通过cDNA末端快速扩增技术确定了doxDA的启动子区域及转录起始位点。这些工作对于从整体上了解整个tetH基因簇的基因转录以及对于揭示调控的机制具有一定的意义。 六、RsrS-RsrR双组分调控系统对于S4I途径的调控研究 通过优化的凝胶迁移实验(EMSA)验证了RsrR蛋白与tetH前的启动子序列之间的相互作用。另一方面，构建一系列报告基因探测质粒，pJRD-P360IRS-gusA，pJRD-P148IRS-gusA和pJRD-P90-gusA，在A.caldus体内验证了RsrR蛋白与tetH前的启动子序列之间的相互作用。 结合生物信息学分析，初步确定tetH前的启动子上一段19 bp的反向重复序列(IRS，AACACCTGTTACACCTGTT)极有可能是RsrR蛋白的调控序列。然而，通过DNase I足迹实验，则确定了一段22 bp的调控序列。这两种实验方法各有优势和不足，下一步工作会通过调控序列关键位点突变等方法来确定RsrR蛋白准确的调控序列。 七、A.caldus中RsrS和RsrR结构及cross-talk功能的初步研究 本文通过进化树邻接法分析了RsrS和RsrR两个蛋白可能的来源或者归类，并对其进行了蛋白结构的数学模拟和叠合。结果发现，RsrS-RsrR双组分调控系统与涉及渗透压的双组分调控系统EnvZ-OmpR具有高度相似性。这些分析结果是两者之间能够发生共调控或这cross-talk现象的重要的理论基础。结合之前验证敲除株在连四硫酸盐培养下生长延迟的生理特性，有理由相信极有可能是EnvZ-OmpR在RsrS-RsrR缺失时，保证了两个敲除株在连四硫酸盐里的生长。同时，通过分析得出的几个有关的双组分蛋白(RR)，与tetH基因的启动子序列的EMSA实验，结果A5904_2590(OmpR)确实能够结合tetH前的启动子序列。另一方面，分析了RsrR蛋白结合DNA片段的HTH结构域中一些关键的氨基酸位点。这些分析和研究结果这对于解释连四硫酸盐培养下生长延迟的现象和完善S4l途径的调控机制具有重要的意义。 八、△rsrR、△rsrS中硫代谢相关基因及部分调控基因的研究 A.caldus中S4I途径涉及到连四硫酸盐和硫代硫酸盐之间的互相转化，而硫代硫酸盐又是整个硫代谢系统的重要的中间代谢物，说明S4I途径与其他的硫氧化途径有密切的联系。目前的研究表明了双组分调控系统RsrS-RsrR对S4I途径的调控作用。因此，通过RT-qPCR检测△rsrR、△rsrS敲除株中硫氧化基因的转录变化情况，对于分析S4I途径与其他的硫氧化途径之间的影响和联系具有重要意义。 另一方面，△rsrR、△rsrS敲除株在连四硫酸盐培养基中出现生长延迟。目前的研究结果表明很有可能是与其他双组分调控系统间的共调控或者cross-talk相关。因此，也对敲除株中其他双组分调控系统及单组分调控蛋白的编码基因的转录变化情况进行了检测。 RT-qPCR分析发现， rsrS和rsrR的敲除对于硫代谢相关基因及部分调控基因均有影响。但是，不管是影响的基因数目还是影响的基因表达变化的程度上，rsrR的敲除产生的影响要明显大于rsrS的敲除带来的影响。 九、A.caldus中RsrS-RsrR调控S4I途径的基本模型的提出 通过整个工作的实验结果验证，结合生物信息学分析，提出了A.caldus中RsrS-RsrR调控S4I途径的基本模型。在A.caldus硫代谢系统中的S4I途径中，双组分调控系统中的组氨酸激酶RsrS的感受结构域从连四硫酸盐感受刺激，使其DHp结构域中的活性组氨酸位点从ATP获得磷酸基团后被活化;经过催化结构域CA的催化作用，将磷酸基团转移给双组分调控系统中的调控蛋白RsrR的信号接收结构域REC保守的活性天冬氨酸Asp(D)位点上并被活化;RsrR形成同源二聚体，结合到tetH基因前启动子序列中的调控序列上;激活RNA聚合酶，调控tetH基因簇的转录。tetH和doxDA基因转录后表达产生TetH和DoxDA蛋白，进入周质空间后，实现了连四硫酸盐和硫代硫酸盐之间的互相转化，从而参与到整个硫代谢氧化系统中。 本文通过A.caldusMTH-04全基因组的芯片表达谱分析，分析了喜温硫杆菌在生长过程中硫代谢及相关调控基因的转录变化情况。通过基因无痕敲除技术成功构建了双组分调控系统RsrS-RsrR的敲除菌株;通过体内和体外的实验验证了双组分调控系统RsrS-RsrR对S4I途径的正向调控功能;提出了RsrS-RsrR调控S4I途径的基本模型。这对于A.caldus MTH-04硫氧化系统的调控机制研究是一个创新，为该项目的工作开展构建了优秀的实验平台，同时也提出了新的问题和挑战。