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本论文以一株绿色产色链霉菌为研究对象,对绿色产色链霉菌的代谢产物进行了一系列的研究,包括绿色产色链霉菌高活性抗菌菌株的选育、生产工艺、代谢产物安全性、代谢产物中抗菌活性成分的分离工艺、代谢产物的动物应用效果等。在一系列研究工作的基础上开发出一种能够显著改善动物饲喂条件的新型发酵床。
利用产气梭状芽孢杆菌作为指示菌株,以代谢产物的抑菌活性为指标,依次利用同步辐射软X射线、低能离子束诱变、紫外诱变、微波诱变技术对绿色产色链霉菌的原始菌株进行诱变选育,得到一株诱变菌株W26菌株,该菌株遗传性状稳定、其代谢产物的抗菌能力较高。因此,确定绿色产色链霉菌诱变菌株W26菌株为本研究的目标菌株。
针对W26菌株液体发酵工艺进行了研究。通过正交试验优化了W26菌株的摇瓶液体培养基,同时对发酵条件进行了探讨。研究结果表明:W26菌株摇瓶液体最佳培养基配方为:(NH4)2SO42%、蛋白胨2%、甘露醇0.5%、豆粕粉3%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.1%、MgSO4·7H2O0.05%、K2HPO4 0.01%。绿色产色链霉菌W26菌株以抑菌活性为指标的最佳摇瓶培养条件为:装液量120ml∕250ml、接种量为15%、种龄3d、转速130r/m,培养时间为42h,培养温度为28℃。同时详细研究了在中试发酵过程中通气量和搅拌速度对W26菌株菌体生长和抗菌活性物质积累的影响,实验结果显示以摇瓶发酵最佳培养基为中试培养基,以10%的接种量进行接种,搅拌速度为240r/m、通气量为1.5V/V·min、发酵培养36h时菌株代谢产物中抑菌活性成分的累积最多。
对利用中试发酵过程获得的W26菌株的发酵菌丝体进行了抑菌活性追踪下的抗菌活性成分的研究。结果表明,绿色产色链霉菌代谢产物中的抑菌活性成分在丙酮中的溶解度较高。利用反复硅胶柱层析对丙酮相进行进一步纯化之后,得到一种已知化合物阿维拉霉素A组分和一个具有较高抗菌活性的组分样品Ⅹ,对样品Ⅹ进行后续反复硅胶柱层析纯化后得到具有抗菌活性的样品5,利用高效液相色谱、液质联用(LC-MS)等分析方法对样品5进行研究之后发现,样品5的分子式为C79H80O19Cl2,相对分子量为1402。
对绿色产色链霉菌的发酵菌丝体进行了安全性评价,结果表明:根据小鼠急性经口毒性分级标准,绿色产色链霉菌W26菌株代谢产物属无毒级;Ames试验未检出绿色产色链霉菌代谢产物有明显的诱变活性;小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验也见发酵代谢产物对小鼠骨髓嗜多染红细胞具有诱发微核作用;小鼠睾丸初级精母细胞染色体畸变分析表明绿色产色链霉菌发酵代谢产物对雄性小鼠睾丸初级精母细胞染色体无诱变活性。以上安全性评价试验结果说明绿色产色链霉菌发酵代谢产物在动物实验中是安全的。
以青脚土杂肉鸡作为实验动物,对绿色产色链霉菌发酵代谢物的实际应用效果进行了研究,结果表明肉鸡日粮中按照600mg∕kg的添加量添加绿色产色链霉菌的液体发酵菌丝体可以显著提高肉鸡日增重、降低日均耗料量、改善饲料的转化率,提高肉鸡的抗病能力和屠宰性能。发酵菌丝体在动物日粮中的添加虽然可以提高肉鸡肌肉中灰分、必需氨基酸的含量,但是效果不显著。在猪的应用实验中,绿色产色链霉菌的菌丝体按照600mg∕kg的添加比例添加到日粮中可以显著提高断奶仔猪和生长猪的生长性能,降低生长猪的腹泻率。
为进一步开发绿色产色链霉菌发酵代谢产物在动物应用中的潜力,本研究在自行分离、制备徐州当地土著微生物的基础上添加一定数量的乳酸菌和芽孢杆菌作为发酵原种,并在液体发酵的过程中经抗生素抗性筛选,获得了高抗性的微生物原种,研制出一种新型发酵床。利用新型发酵床进行动物养殖可以显著提高动物的生长性能,改善动物肌肉品质。将发酵床协同绿色产色链霉菌发酵菌丝体进行畜禽养殖比发酵床单一作用效果更强。