抑藻表面活性剂产生菌的高通量筛选及其发酵条件优化

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赤潮是一种严重的全球性海洋灾害,它会造成严重的生态、资源、环境问题和重大的经济损失。近年来,赤潮发生次数增多,发生区域扩大,赤潮危害加剧。因此,寻求有效的赤潮防治方法成为当务之急。海洋细菌在赤潮生消过程中有着极其重要的作用,而细菌杀藻现象的发现也为微生物防治赤潮提供了新的可能途径,“菌藻关系”研究已经成为当前赤潮研究的重点和热点。   本论文选取典型有害赤潮藻——锥状斯氏藻(Scrippsiellatrochoidea)作为主要研究藻种,基于高通量培养-筛选方法,从实验室保存的东海海域赤潮高发区分离菌株中筛选到能产表面活性物质的3株海洋杀藻细菌。研究了其中1株杀藻菌发酵条件,并对其分泌的杀藻表面活性物质的分离纯化进行了初步研究。本文选取乳化效果最好的菌株Halomonossp.DH77-1,以乳化活性为导向从其发酵液提取物中分离、纯化具有杀藻活性的化合物。主要结论如下:   1.整合高通量培养和液滴崩塌表面活性剂产生菌筛选法,建立了表面活性剂产生菌的高通量筛选流程。采用该方法从实验室保存的300余株东海海域赤潮高发区所分离到的菌株中筛选获得3株产表面活性剂海洋细菌,经鉴定分属于盐单胞菌属(Halomonas)和芽孢杆菌属(Bacillus),其中Halomonassp.DHQ19发酵液具有优良的乳化活性,其24h乳化指数EI24(emulsificationindex)高达69%。   2.采用单因子优化方法对菌株Halomonassp.DHQ19合成乳化活性物质的发酵条件进行了初步优化。考察了氮源、碳源、镁、盐度、初始pH,装液量,发酵时间等因素对Halomonassp.DHQ19发酵液乳化活性的影响。初步确定发酵培养基为:甘露醇10g,谷氨酸0.6g,硫酸铵2g,磷酸二氢钾2g,磷酸氢二钾5g,七水合硫酸镁1g,氯化钠8g,pH7.5,蒸馏水定容至1L;培养条件为:转速150rpm,装液量1/5,30℃培养72h。   3.采用多级醇析法、超滤法和DEAE-琼脂糖离子柱层析法对发酵液中的乳化活性物质进行初步分离,并对分离获得的层析组分进行了最小抑藻浓度的检测。通过多级醇析分离获得5个不同级分,合并具有乳化活性的40%和50%醇析级分后,进行超滤除去小分子物质收集100KD截留物,再通过DEAE-琼脂糖离子柱层析进一步分离纯化,获得组分A和组分B,通过超滤方法除盐后冻干保存。组分A的最小抑藻浓度为50mg/L,组分B的最小抑藻浓度为200mg/L。
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