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研究背景药物依赖是目前国内外普遍关注的一个严重社会问题。药物滥用主要是指海洛因、鸦片、大麻、吗啡、可卡因、甲基苯丙胺以及国家规定管制的其他能够使人形成瘾癖的麻醉药品和精神药品的滥用。可产生依赖的药物基本可分为以下几类,即:酒精类、鸦片类、镇静催眠剂、大麻类、可卡因类、烟草、挥发性溶剂;其他兴奋剂包括咖啡因、致幻剂类等。国内的药物依赖研究主要以神经细胞和大、小鼠动物模型为主,本课题研究是建立在斑马鱼吗啡依赖模型的基础上,与小鼠吗啡依赖模型进行比较研究,明确斑马鱼和小鼠吗啡依赖模型在行为学和其发生机制的变化特征。斑马鱼吗啡依赖模型和小鼠吗啡依赖模型为药物依赖研究提供了新的模型依据,而斑马鱼模型成为药物依赖动物模型的选择之一。条件性位置偏爱模型是测量动物的奖赏效应的最有效手段之一。目前国内利用条件性位置偏爱进行药物依赖的研究主要集中在大小鼠等啮齿动物模型,而少有利用其它模型来进行药物依赖研究的报道。根据国内外吗啡模型建立及检测资料,本课题旨在复制出斑马鱼和小鼠的吗啡依赖位置偏爱模型,并用中药活性成分青藤碱对斑马鱼和小鼠吗啡依赖位置偏爱模型进行干预,并观察青藤碱对斑马鱼和小鼠吗啡依赖模型的影响及相关蛋白变化,将对二者进行比较研究,确定斑马鱼吗啡依赖模型建立的科学性、合理性、可行性和实用性,并得出斑马鱼和小鼠吗啡依赖模型各自的优势和不足之处。实验目的1.建立小鼠和成年斑马鱼的吗啡CPP动物模型,观察小鼠和成年斑马鱼CPP效应,从行为学方面来对比小鼠和成年斑马鱼两种模型的依赖效果,同时用中药有效成分青藤碱碱进行干预,对比观察形成依赖后不同动物模型的行为变化。2.采用荧光定量PCR的方法,检测吗啡诱导的斑马鱼和小鼠脑内阿片受体水平的变化,并观察中药有成分青藤碱干预后,斑马鱼脑内相关受体水平的变化的对比。3.采用免疫组化的方法,检测吗啡诱导的斑马鱼和小鼠脑内TH和NR2B受体表达的变化,并观察中药有效成分青藤碱干预后,相关受体表达水平是否发生改变阳性细胞数目的改变及中药活性成分青藤碱对其干预后变化情况的对比。4.通过对两种动物模型不同组别及指标结果的分析,对比两种模型造模及给药后不同指标的改变趋势。根据统计学原理,采用相关性分析方法,用相关系数(r)方法考察两种动物模型及给予中药活性成分青藤碱干预后不同指标之间的相关性的情况。实验方法1.参照课题组前期研究成果建立小鼠和成年斑马鱼吗啡条件性位置偏爱模型,从行为学方面来对比小鼠和成年斑马鱼两种模型的依赖CPP效果。取符合实验条件的50只小鼠,按随机原则分为5个组:即(1)空白对照组,(2)盐酸吗啡(9mg/kg)模型组,(3)青藤碱低剂量(40mg/kg)组,(4)青藤碱高剂量(80mg/kg)组,(5)美沙酮(15mg/kg)组,每组10只小鼠,雌雄各半。(2)～(5)组每天上午(8:00)皮下注射盐酸吗啡4mg/kg,连续4d;(1)组注射同体积生理盐水,其它处理同②组;(3)和(4)组每天上午(7:30,即注射盐酸吗啡前30min)腹腔注射相应剂量的青藤碱,连续3天;(5)组从第二天起在注射盐酸吗啡之前15min,腹腔注射美沙酮(15mg/kg),连续3d。各组下午(16:00,间隔8h)均给予生理盐水(0.15ml,sc)1次。将箱体中间的隔板置于中间,第一天上午注射生理盐水或盐酸吗啡后立即将小鼠置于白箱,下午注射生理盐水后立即将小鼠置于黑箱,均放置lh,连续4天。24h后(第5天)进行位置偏爱检测,记录小鼠5min内在白箱中停留的时间。取符合实验条件的成年斑马鱼50条,按照随机分配原则分为5个组:即空白对照组,吗啡(40μg·g-1)模型组,吗啡+美沙酮组(40μg·g-1),吗啡+青藤碱低剂量组(40μg·g-1),吗啡+青藤碱高剂量组(80μg·g-1),每组10条,雌雄各半。(2)观察:在正式实验(即第一天)测定斑马鱼5 min内在CPP箱透明侧(非偏爱箱)的活动时间,并用NoldusEthoVisionXT8.5软件追踪斑马鱼在CPP箱中的运动轨迹(5min)。(3)训练:于实验第二天、第四天、第六天将成年斑马鱼放入50 mg·L-1的tricaine methanesulfonate溶液中进行麻醉,各组均腹腔注射40 μg·g-1的吗啡(空白组注射生理盐水),再将其放入系统水中30s,待其麻醉恢复后,将其放入伴药箱内40min,同时用透明挡板隔开,训练结束后将斑马鱼移至较大的有蓝色环境的鱼缸中,并清洗CPP箱。第三天、第五天同一时间斑马鱼腹腔注射与吗啡同体积生理盐水,将其放入偏爱箱内40 min。(4)给药:青藤碱高低剂量组和美沙酮给药组斑马鱼于每日训练12h后腹腔注射相应的药物,生理盐水组和模型组注射同体积生理盐水。(5)观察:在末次给药12h后即d7再次测定斑马鱼在非偏爱箱中的活动时间,同时分析斑马鱼在非偏爱箱中的运动轨迹。2.采用免疫组化法,观测吗啡条件性位置偏爱小鼠和成年斑马鱼脑内TH、NR2B阳性细胞数的改变及中药活性成分青藤碱对其干预后变化情况的对比。将各组动物组织(小鼠取整个脑组织,斑马鱼取整个头部)于4%多聚甲醛(PFA)中固定,进行常规石蜡包埋,切片,免疫组化染色,显微镜下进行观察,拍片,观察阳性颗粒在细胞内的分布,细胞中出现棕褐色颗粒为阳性。采用Image-Proplus 6.0图像分析软件,测定阳性细胞的积分光密度(IOD)。3.青藤碱对吗啡依赖小鼠和斑马鱼脑内阿片受体表达的影响对比各组斑马鱼行为学指标检测结束后,斑马鱼迅速冷冻处死,显微镜下取脑组织。采用荧光定量PCR技术检测各组小鼠脑组织中的mor和dorRNA的表达和斑马鱼脑组织中zfmor、zfdor1、zfdor2 mRNA的表达。4.统计方法统计结果均采用均值±标准差(x±s)的形式表示,采用spss19.0统计学软件进行处理,两组间比较采用t检验,组内差异采用单因素方差分析。P<0.05为有统计学意义。实验结果1、行为学实验结果行为学结果显示:给予一定量盐酸吗啡后,小鼠及成年斑马鱼依赖模型均产生位置偏爱效应,与空白组对比有统计学意义(P<0.05),通过青藤碱干预均对吗啡诱导的位置偏爱有调节作用。并且小鼠与斑马鱼的伴药箱中逗留的时间存在正相关r =0.606,P=0.000。2、TH实验结果免疫组化结果显示:小鼠与成年斑马鱼吗啡依赖模型脑内TH阳性细胞数均显著增加(P<0.05),通过青藤碱干预均有一定的改善作用。斑马鱼与小鼠的脑内TH阳性细胞数两组数据呈正相关r =0.677,P=0.000。3、NR2B实验结果免疫组化结果显示:小鼠及成年斑马鱼吗啡依赖模型脑内NR2B阳性细胞数均增加(P<0.05),通过青藤碱干预均有一定的改善作用。斑马鱼与小鼠脑内NR2B阳性细胞数两组数据呈正相关r =0.429,P>=0.000。4、荧光定量PCR实验结果PCR结果显示斑马鱼和小鼠,小鼠脑内μ阿片受体(mor)和δ阿片受体(dor)的相对表达量,与空白对照组相比,均显著降低(P<0.01)。模型组斑马鱼脑内μ阿片受体(zfinor)和δ阿片受体(zfdor1和zfdor2)的相对表达量,与空白组相比,均显著降低(P<0.05)。通过青藤碱干预后均对μ阿片受体(zfmor)和δ阿片受体(zfdor1和zfdor2)的相对表达量有一定改善作用,并且斑马鱼和小鼠两个受体相对表达量呈正相关r =0.328,P=0.000。结论1、在给予一定量盐酸吗啡后,小鼠及成年斑马鱼吗啡依赖模型均产生CPP效应,说明与成熟的小鼠吗啡依赖模型相比,斑马鱼吗啡依赖模型是可复制的、稳定的、成功的。2、通过对TH、NR2B两个指标免疫组化结果的分析,提示斑马鱼和小鼠两种动物模型在神经生物学作用机制相似,表明斑马鱼动物模型在一定条件下可以作为评价药物依赖的一种新模型。3、通过青藤碱干预后,对小鼠及成年斑马鱼吗啡依赖模型行为学、TH、NR2B、PCR(mor和dor)三个指标均有调节作用,两组数据间基本都存在正相关,提示青藤碱对两种模型效果相近,斑马鱼模型由于具有周期短、用药少、体型小、成本相对低等优势,为进行药物依赖的研究和中药活性成分的筛选提供了新的科学依据。