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目的:tumstatin是由Ⅳ型胶原α3链的中间3股螺旋区域C-端12个氨基酸和非胶原区1(NC1)232个氨基酸,共244个氨基酸组成。对体外、体内新生血管形成和肿瘤移植瘤模型的研究表明重组tumstatin显著抑制血管内皮细胞增殖、特异性诱导内皮细胞凋亡,进而抑制肿瘤生长。本研究利用Taqman技术,建立荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法,定量检测肺癌组织中tumstatin/Ⅳ型胶原α3链[α3(Ⅳ)]mRNA表达水平,运用免疫组化和Western-Blot法检测相应组织tumstatin/Ⅳ型胶原α3链蛋白表达水平,评价肺癌患者tumstatin/α3(Ⅳ)基因表达和蛋白表达及两者之间的变化在肺癌发生发展中的临床应用价值。 方法:①收集已确诊的行手术切除的原发肺癌患者48例,获取肺癌组织及癌旁正常组织。②在α3(Ⅳ)基因NC1结构域编码序列设计一对引物和一条Taqman探针;优化反应体系的条件,以不同质粒DNA含量为标准品和其循环阈值(Ct值)制作标准曲线,检测肺癌组织中α3(Ⅳ)mRNA含量;并对本方法进行方法学评价。③采用蛋白免疫印记(Western-Blot)方法和免疫组化检测肺癌组织和癌旁组织标本中tumstatin/α3(Ⅳ)蛋白表达水平,进一步探讨肺癌发生发展与其蛋白表达之间的关系。④CD31单抗检测肺癌组织和癌旁组织血管密度MVD,分析tumstatin/α3(Ⅳ)与MVD的相关性。 结果:成功建立了α3(Ⅳ)基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,检测灵敏度为800拷贝/μl;在103～108拷贝/μl之间与Ct值具有很好的线性关系;PCR扩增效率为99.4％;肺癌组织中α3(Ⅳ)mRNA表达定量检测发现,48例肺癌患者肺癌组织α3(Ⅳ)mRNA组含量显著低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.01),Western-Blot和免疫组化的检测,肺癌组织中tumstatin/α3(Ⅳ)蛋白表达下调/缺失率显著高于癌旁组织(P<0.01)。临床监测发现肺癌患者癌组织α3(Ⅳ) mRNA含量检测和TNM分期程度具有相关性(P<0.05)。 结论:tumstatin/α3(Ⅳ)表达与肺癌组织中微血管密度关系密切相关,肺癌组织中tumstatin/α3(Ⅳ)基因低表达是导致其蛋白表达缺失的重要机制之一,在肺癌的发生发展过程中起到重要作用,可作为评估肺癌恶性程度和淋巴结转移程度的有效分子生物学指标。