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第一部分：TMEM25在癲痫脑组织中表达变化及对癲痫动物模型行为学影响 目的:检测在癫痫患者及动物模型脑组织中的TMEM25表达水平;观察TMEM25对PTZ慢性点燃模型和KA慢性癫痫模型行为学的影响。 方法： 1.从本团队前期建立的脑库中随机抽取20例癫痫术后脑组织（实验组），10例脑外伤患者术后脑组织〔对照组）。 2.用成年雄性C57BL/6小鼠，KA海马注射诱导SE后慢性癫痫模型，分为有自发性发作（SRS)组和无自发性发作（non-SRS)组；PTZ腹腔注射构建慢性点燃小鼠模型，分为点燃成功组和未点燃成功组。 3.检测癫痫组和对照组TMEM25表达变化情况。 4.成年雄性C57BL/6小鼠随机分为四组：海马立体定位注射干扰空病毒组(Son-shRNA);干扰病毒组(LV-shTM25);过表达空病毒组(Con-LV-TM25);TMEM25过表达组(LV-TM25)。 5.分别用免疫荧光、免疫印迹技术检测慢病毒感染海马效率。 6.PTZ慢性点燃模型行为学观察：海马立体定位注射病毒两周后，我们利用PTZ（35mg/kg）每隔天进行1次腹腔注射，观察PTZ注射后半小时内发作分级。 7.海人酸癫痫模型行为学观察：造模后1个月内持续视频监测小鼠SRS情况。统计各组IVorVSRS频率和潜伏期（Racine评分)，在体电生理检测小鼠脑电活动情况，评估自发性发作的严重程度。 结果： 1.与对照组相比，TMEM25在难治性癫痫患者及两种慢性癫痫动物模型脑组织中均表达显著下降（*p<0.05)。 2.免疫荧光结果显示，在癫痫脑组织中TMEM25也是只与神经元标记物微管相关蛋白共表达，而与星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白无共表达；与免疫印迹结果相似，TMEM25在癫痫脑组织中的荧光强度也降低。 3.慢病毒载体LV-shTM25、LV-TM25、Con-shRNA和Con-LV-TM25海马立体定位注射后6周后，免疫荧光结果显示海马CA1和齿状回均有mCherry阳性表达。免疫印迹结果显示，与空病毒对照组相比，LV-shTM25组OD值在病毒注射后第6周显著降低（*p<0.05），LV-TM25过表达组OD值在病毒注射后第6周显著增加（*p<0.05）。 4.PTZ慢性点燃过程中，与对照组相比，LV-shTM25组各时间点平均发作分级显著升高，LV-TM25过表达组各时间点平均发作分级显著降低（*p<0.05，**p<0.01）。 5.海人酸诱导的SE后（1-4w)，与对照组相比，LV-shTM25组自发性发作次数显著增加，TMEM25过表达组自发性发作次数显著降低（*p<0.05，**p<0.01）。 结论： 1.免疫荧光及免疫印迹结果均显示TMEM25在难治性TLE患者和两种慢性癫痫小鼠模型脑组织中表达明显降低，提示TMEM25可能参与了癫痫的发生发展。 2.慢病毒LV-shTM25和LV-TM25海马立体定位注射后可显著改变海马TMEM25的表达，转染在注射后6周有效。 3.慢病毒LV-shTM25介导的海马TMEM25过表达能减轻PTZ慢性点燃过程中各时间点平均发作分级，LV-shTM25产生相反的结果。 4.慢病毒LV-TM25介导的海马TMEM25过表达能减少海人酸诱导的慢性期自发性发作的次数并减轻发作严重程度，LV-shTM25干扰TMEM25表达则产生相反的结果。 第二部分：TMEM25在神经系统中的亚细胞定位研究 目的：检测TMEM25在神经系统中的亚细胞定位情况。 方法： 1.应用分子克隆技术，构建携带mCherry标签和TMEM25基因的重组质粒，用于后续细胞转染研究。 2.培养并转染HEK293细胞，将携带mCherry融合标签的TMEM25质粒转染HEK293细胞，在激光共聚焦显微镜下观察TMEM25在HEK293细胞内的亚细胞定位。 3.体外培养小鼠海马神经元，用免疫荧光方法检测HEK293在神经元中的亚细胞定位。 结果： 1.TMEM25在体外培养神经元及HEK293细胞中定位的研究结果显示，TMEM25主要分布在胞体，根据其分布形式考虑TMEM25可能分布于一种胞内、囊泡状细胞器。 2.免疫荧光结果显示TMEM25与晚期内吞体/溶酶体标记物LAMP2共定位，而与早期内吞体标记物EEA1不共定位。 结论：TMEM25主要定位于神经元的溶酶体，是定位于溶酶体的跨膜蛋白。 第三部分：TMEM25在神经系统中的功能研究 目的：为进一步探讨TMEM25在神经系统中的功能，了解TMEM25对神经元兴奋性及突触传递的影响。 方法： 1.构建携带有TMEM25过表达基因和TMEM25-shRNA的慢病毒载体。 2.成年雄性C57BL/6小鼠随机分为四组，干扰对照组(Con-shRNA)、干扰组(LV-shTM25)、过表达对照组（Con-LV-TM25）和过表达组（LV-TM25），利用海马立体定位注射相应慢病毒干预海马内源性TMEM25表达。 3.病毒注射两周后分别用免疫荧光、免疫印迹技术检测小鼠海马组织慢病毒感染效率。 4.病毒注射两周后取材制作海马脑片，采用全细胞膜片钳技术记录慢病毒干扰对各组小鼠海马CA1区锥体神经元动作电位（APs)、微小兴奋性突触后电流（mEPSC)、微小抑制性突触后电流（mIPSC)、成对脉冲比例（PPR）和evokedNMDAR、AMPAR电流的变化情况。 结果： 全细胞膜片钳技术对海马CA1区锥体神经元记录结果显示，与相应空病毒对照组相比，LV-shTM25组中AP频率显著增髙(*p<0.05)，LV-TM25组AP频率显著降低。与相应空病毒对照组相比，LV-shTM25组中NMDR-mEPSC波幅显著增髙（*p<0.05），LV-TM25组NMDAR-mEPSC波幅均显著降低(*p<0.05)与空病毒对照组相比，LV-TM25和LV-shTM25组NMDAR-mEPSC的频率无显著性差异（p>0.05）。各组之间AMPAR-mRPSCs和mIPSC的频率、幅值及PPR无显著性差异(p>0.05)。与空病毒组比较，LV-shTM25组的NMAR/AMPARratio及NMDAR依赖性evokedEPSCs（eEPSCs）幅度显著增高，LV-TM25组的NMAR/AMPARratio及NMDAR依赖性eEPSCs幅值显著降低;而AMPAR依赖性eEPSCs幅度无显著性差异。 结论： 膜片钳结果提示改变小鼠海马中TMEM25表达能调节海马CA1区神经元的兴奋性，干扰内源性TMEM25表达能增加海马CA1区锥体神经元的AP频率、NMDAR-mEPSC幅度及NMAR/AMPARratio；过表达TMEM25能显著减低海马CA1区锥体神经元的AP频率、NMDAR-mEPSC幅值及NMAR/AMPARratio。 第四部分：TMEM25影响NMDA受体的机制研究 目的：为进一步探讨TMEM25与NMDA受体之间的关系及其调节的机制。 方法： 1.成年雄性C57BL/6小鼠随机分为四组，干扰对照组（Con-shRNA）干扰组（LV-shTM25）、过表达对照组（Con-LV-TM25）和过表达组（LV-TM25）利用海马立体定位注射相应慢病毒干预海马内源性TMEM25表达。 2.免疫印迹法检测小鼠海马NMDA受体的总蛋白和膜蛋白表达情况。 3^免疫荧光及免疫共沉淀检测小鼠海马中TMEM25和NMDA受体之间相互作用情况。 I溶酶体探针检测TMEM25对体外培养神经元溶酶体酸化水平的影响。 5‘放线菌酮阻断实验检测调节TMEM25表达水平对NR2B亚基降解速率的影响。 结果： 1.免疫印迹结果显示，LV-shTM25组NMDA受体NR2B亚基总蛋白显著增加（*p<0.05），LV-TM25过表达组NR2B总蛋白明显降低（*p<0.05），但是干预内源性TMEM25表达对NMDA受体NR1和NR2A亚基总蛋白表达量无显著影响(p>0.05)。 2.免疫荧光及免疫共沉淀结果显示小鼠海马组织中内源性TMEM25和内源性NMDA受体NR2B亚基两者共定位及相互作用。 3.与相应空病毒对照组相比，LV-shTM25组中溶酶体探针荧光强度显著降低（*p<0.05）,而LV-TM25组中溶酶体探针荧光强度显著增高（*p<0.05）。 4.与Con-LV-TM25组比较，LV-TM25组NR2B蛋白剩余量降低;与Con-shRNA组比较，LV-shTM25组NR2B蛋白剩余量增高（*p<0.05;**p<0.01）。 结论： 1.小鼠海马组织中，LV-TM25与NMDA受体NR2B亚基之间存在相互作用，TMEM25同时影响了NMDA受体NR2B亚基总蛋白和膜蛋白表达量，而不影响NR1和NR2A入亚基。 2.TMEM25亚细胞定位于神经元溶酶体上，且与NR2B共定位于溶酶体。TMEM25上调能增加溶酶体酸化水平，加速NR2B降解，TMEM25下调能降低溶酶体酸化水平，减慢NR2B降解速度。