【摘 要】
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有机磷农药因具有高效、种类繁多、低价等特点而被广泛使用。由于有机磷农药的过度使用导致严重的环境污染及非靶向生物体有严重的毒性。因此加强对环境、食品中的有机磷农药
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有机磷农药因具有高效、种类繁多、低价等特点而被广泛使用。由于有机磷农药的过度使用导致严重的环境污染及非靶向生物体有严重的毒性。因此加强对环境、食品中的有机磷农药含量的检测十分重要。检测有机磷农药含量最常用的酶抑制法所用的酶源为乙酰胆碱酯酶(AChE)。 AChE作为重要的酶源在检测中仍存在以下问题：灵敏度有待提高；其次因有机磷类农药数量庞大,单一AChE无法满足所有有机磷化合物检测。因此我们希望通过生物技术,以AChE结构类似丁酰胆碱酯酶BChE作为改造对象以期能够获得灵敏度更好,检测范围更广的酶源。BChE与AChE在结构和性质上相似,且早期已有科学家尝试用丁酰胆碱酯酶来作为检测的酶源。通过对BChE结构的深刻学习和认识,我们对人源丁酰胆碱酯酶ABChE活性腔中部分重要位点的改造,利用定点突变、真核表达、蛋白质纯化以及酶动力学检测等手段共得到近40个ABChE突变体,并且成功建立了突变ABChE检测有机磷的筛选模型。通过双分子速率常数测定发现hAChE对丙溴磷无法识别,ABChE较hAChE对敌敌畏、丙溴磷、辛硫磷识别效果更佳。而通过突变体筛选,找到F227、S287、N68、P285等位点对于识别有影响。得到了突变体A328W对乙基对氧磷在检测速度上有近17.9倍的提高。
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