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研究背景及目的目前冠心病治疗领域最受关注的新理论和方法是治疗性血管新生,其根据血管发育原理通过刺激心肌缺血区小血管生长和侧支循环形成达到改善心肌缺血的目的,代表着冠心病治疗的新方向。胚胎干细胞(ESCs)是早期胚胎经体外分化建立的多能性细胞系,体外培养时保持未分化状态,可以传代增殖。ESCs具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特点,是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。基因转染技术是将具有生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能,进而应用于基因组功能研究(基因表达调控、基因功能、信号转导和药物筛选研究)和基因治疗研究。在转基因领域,ESCs是公认的研究基因转移、基因定位整合的一类极有前途的实验材料,但实际操作中ESCs外源基因转染方法不够统一,转染效率差异较大,阳性克隆筛选标准不一致。在体外培养条件下,ESCs于成纤维细胞形成的饲养层上培养在白血病抑制因子(LIF)存在时,能够维持全能干细胞的分化特性。剔除上述因素后,ESCs可以自发地分化成单层细胞并聚集生长成胚胎小体(EBs)。EBs模型可以模拟胚胎早期发育过程,其结合基因转染技术成为血管发育生物学的一种重要研究工具。RhoA、Rac1和Cdc42是目前研究最多的Rho家族成员,Rho GTP酶可以调节生长因子的信号转导,但对血管发育早期成血管细胞的增生和分化中的作用还所知甚少。本研究针对小鼠ESCs在不同饲养层细胞上的生长状态进行观察,并针对外源基因转染小鼠ESCs的不同方法进行比较,探讨小鼠ESCs外源基因转染方法的可行性和有效性。同时通过成功转染pcDNA3.1+Rac1G12V及pcDNA3.1+Rac1T17N质粒的ESCs株所建立的体外发育EBs模型,探讨血管发育早期Rac1在成血管细胞来源、血管形成过程中的调控作用和血管分化的变化规律,为进一步阐明血管成熟、血管重塑及冠心病治疗性血管新生奠定基础。材料与方法1.细胞培养小鼠ESCs株R1(ATCC)培养于丝裂霉素(10mg/L,2h)处理后的饲养层细胞STO(小鼠成纤维细胞株,ATCC)或MEF(本室制备)上。ESCs在生长到亚融合状态时进行传代,每天换液以维持其未分化状态。2.载体构建pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+Rac1G12V质粒经扩增、测序、酶切线性化并回收纯化。将更换为PGK启动子的pEGFP-C1以及pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+Rac1G12V质粒行KpnⅠ/ApaⅠ双酶切,目的片断回收后,行连接反应,转化感受态细胞,提取新构建质粒pPGK-Rac1G12V和pPGK-Rac1T17N,酶切鉴定并送测序。3. ESCs转染用电穿孔法将线性化的pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+ Rac1G12V载体转染到ESCs R1细胞。按Lipofectamine 2000转染试剂盒说明,将pPGK-Rac1G12V和pPGK-Rac1T17N质粒转染到ESCs R1细胞。将转染后的ESCs在含G418的选择性培养液中培养和筛选。将扩增后10d的转基因ESCs于解剖显微镜下用Pasteur枪头挑取1.5～2mm的细胞克隆行扩增培养。4.基因组PCR鉴定应用Taq PCR试剂盒行基因组DNA PCR分析。所扩增片段为pcDNA3.1+载体中neomycin的cDNA序列。5. ESCs分化及EBs模型的建立ESCs培养至亚融合状态,用0.25%胰酶及0.53mmol/L EDTA消化后,铺于明胶包被的培养皿中,3h后大部分STO细胞已贴壁。将未贴壁的ESCs稀释后接种于细菌培养皿中,培养液为不含LIF的ESCs培养液。悬浮培养后6d,将EBs接种于0.1%明胶铺被的培养皿中贴壁培养,每天换液。6.免疫细胞化学染色固定的EBs经0.05 mol/L TBS洗涤后,在含0.25% Triton X-100和0.5 mol/L NH4Cl的TBS中通透20min。正常山羊血清封闭1h后,与一抗在4℃孵育过夜。抗小鼠抗体包括Rac1、CD31、SMα-actin及Caspase-3。二抗为四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)或异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体。7. RT-PCR参照说明书用Trizol提取不同时间点EBs中的RNA。取RNA1μg进行以下物质的半定量PCR:CD31、SMα-actin及GAPDH。8. SDS-PAGE电泳及Western blot分析通过PULL DOWN分析来检测转染后ESCs、EBs中Rac1的表达活性。将收集的不同活性Rac1蛋白或其他蛋白,分别行12%SDS-PAGE电泳。一抗4℃杂交过夜,二抗(HRP标记的IgG)室温杂交2h。ECL化学发光试剂盒发光显影,于暗室条件下压X光片。结果1.饲养层细胞形态及ESCs R1的生长状态MEF为长梭形细胞,呈条索状或漩涡状生长。而STO呈现短梭形,细胞形态整齐、边缘清晰。在MEF饲养层上,R1克隆致密,呈椭圆形生长,界限清楚,核仁清晰,ESCs之间看不清细胞界限。在STO饲养层上,R1呈巢状(集落状)隆起生长,边缘清楚,表面平滑,结构致密,以圆形为主,细胞核及核仁无法辨认。2.不同饲养层来源的ESCs培养为EBs的比较培养发现,STO上生长的ESCs尽管生长速度较慢,但发育为EBs的形成率较高(约40%),结构致密,且多数能够发育出三胚层结构。而MEF上生长的ESCs,生长速度较快,但较容易分化,结构较疏松,培养成EBs的形成率较低(约10%),且不易分化形成三胚层结构。3.载体构建及阳性ESCs克隆筛选pPGK-EGFP-Rac1G12V、pPGK- EGFP-Rac1T17N载体经KpnⅠ/ApaⅠ双酶切后鉴定,与预期片断大小一致,送TAKALA公司测序显示载体中所插入Rac1G12V、Rac1T17N片断与载体库中序列完全一致,并且与PGK、EGFP方向一致。电穿孔行G418筛选48h后转染阴性细胞死亡明显增加,到第5d大部分未转染的细胞团已经死亡,继续培养至10d左右,可观察到小的阳性细胞克隆。共扩增两种转染细胞22株。经基因组PCR证实,每组各有3株为成功转染克隆。脂质体转染后24h可以观察到阳性克隆表达EGFP,但不同饲养层上的ESCs R1转染效率不同。MEF上的ESCs R1转染效率较高,为60.7±11.4%,而STO上生长的ESCs R1转染效率较低,10.8±7.5%,差异有统计学意义。4. RT-PCR及Western blot检测ESCs及EBs中的Rac1表达转染pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+Rac1G12V的ESCs及其来源的EBs,其Rac1 mRNA与蛋白表达无差异,而PULL DOWN显示活性Rac1蛋白表达在Rac1G12V EBs中增加3～4倍,在Rac1T17N EBs中明显减少。5. EBs模型的建立及形态特征培养转染后ESCs,建立EBs模型,模拟血管发生及血管新生过程,发现转染持续活化型Rac1G12V质粒的ESCs可以象野生型ESCs一样,发育成为致密结构的EBs,7～9d分化形成三胚层结构,而转染主导抑制型Rac1T17N质粒的ESCs发育成的EBs结构疏松,不能分化形成完整的三胚层结构。转染Rac1G12V的ESCs形成EBs过程中囊腔细胞凋亡发生较早,并可见CD31阳性标志的细胞出现,而转染Rac1T17N的ESCs形成EBs过程中囊腔细胞凋亡发生较晚,无CD31阳性标志的细胞出现。6. EBs贴壁分化模型观察将转染两种调控型ESCs来源的EBs贴壁培养发现,转染Rac1G12V的EBs细胞分化活跃、迁移明显,Rhodamine-Phalloidine染色见细胞骨架完整、应力纤维分布均匀,部分游走细胞脱离EBs,可见CD31、SMα-actin染色阳性;而Rac1T17N来源的EBs细胞分化受阻、迁移受限,EBs边缘的细胞Rhodamine-Phalloidine染色见应力纤维较少,较多集中在胞膜附近,无细胞游走出现。RT-PCR和Western blot显示前者CD31 RNA及蛋白表达时相较早,于E6+6d开始表达,后者表达较晚且表达量较少。转染Rac1G12V的EBs贴壁分化后可以形成内皮为主的血管网结构(细胞吞噬DiI LDL活跃),而Rac1T17N来源的EBs贴壁培养无血管网结构出现(细胞吞噬DiI LDL较少)。结论转染Rac1不同调控型质粒建立EBs模型,可以模拟胚胎发育早期血管发育过程,观察Rac1在其中的调控作用。Rac1在胚胎发育早期是调控胚层分化的必须基因,调控囊腔细胞凋亡、内皮细胞(ECs)发生、ECs游走等过程,进而调控血管发育进程。脂质体转染ESCs是一种高效实用的转染方法,但易用MEF作为饲养层进行转染,STO可作为药物筛选及培养EBs的首选饲养层细胞。