毛细管电泳/微流控芯片技术在复杂生物样本分析中的应用

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生物样品成分复杂多样,而其中一些目标分析物的含量通常比较低,实现生物样品中微量组分的快速、灵敏、有效的分析,仍然是当前科研工作者面临的一项巨大挑战。因此,建立复杂基质体系中微量组分快速、灵敏、有效的分离分析方法具有非常重要的现实意义。毛细管电泳和微流控芯片技术作为微型液相分析技术,由于具有分析速度快、分离效率高、样品和试剂消耗少等特点,已被广泛应用于生命科学、医学、食品、环境等领域。与此同时,它们与高灵敏检测器(如电化学检测器和激光诱导荧光检测器)的联用,给复杂生物样本中微量组分的分离分析提供了一个良好的分析平台。  本论文我们利用毛细管电泳和微流控芯片技术建立了人体尿样中8-羟基-2-脱氧鸟苷以及生物样本中瘦肉精和氨基糖苷类抗生素的分析方法。  具体研究内容如下:  1.毛细管电泳-激光诱导荧光检测技术分析人体尿液中DNA氧化损伤标志物8-羟基-2-脱氧鸟苷的研究  8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)作为一种重要的DNA氧化损伤产物,目前已成为评价DNA氧化损伤程度较为常用的生物标志物之一。然而由于生物样本中8-OHdG含量较低,基质干扰严重,目前仍难于准确检测生物样本中痕量水平的8-OHdG,限制了它在DNA氧化损伤评价方面的应用。毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)检测技术由于同时兼具了毛细管电泳高分辨率和激光诱导荧光检测器高灵敏度的优势,非常适合于复杂体系中微量组分的分析。本章我们以4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑为荧光衍生试剂,对8-OHdG进行柱前衍生建立了一种简单、灵敏的CE-LIF技术分析人体尿液中8-OHdG的新方法。通过考察衍生及电泳分离条件对8-OHdG荧光衍生效率和电泳分离的影响,在优化实验条件下,避免了尿样基质的干扰,成功实现了尿样中8-OHdG的检测。将该方法应用于分析来自7组健康志愿者尿样中的8-OHdG,并将实验结果与ELISA分析方法所得结果进行对照,结果令人满意。  2.纸质固相微萃取用于人体尿液中8-OHdG的分析  在第一部分研究内容的基础上,考虑到8-OHdG分子内含有氨基和羟基基团,可以与纤维素滤纸上的葡萄糖分子之间形成的较强的氢键作用,从而使纤维素滤纸对8-OHdG具有一定的亲和能力。此外,由于纤维素滤纸具有:1)较大的比表面积,丰富的孔及适宜的孔径结构;2)不与8-OHdG和其相应的介质发生反应,稳定性好;3)良好的机械强度和热稳定性等。因此,在传统固相微萃取的基础上,采用普通纤维素滤纸作为载体,借助纤维素滤纸对8-OHdG的选择性吸附作用,我们发展了一种新型的纸质固相微萃取技术对人体尿液进行预处理,以降低尿液中复杂基质对微量8-OHdG检测的干扰。实验中我们系统考察了各种萃取条件对萃取效率的影响。在优化的实验条件下,大大降低了人体尿液中复杂基质的干扰,提高了分析方法的准确度和可靠性。  3.毛细管胶束电动色谱-紫外检测技术筛查β2受体激动剂的研究  结合液-液萃取技术,发展了一种快速、简单、有效的毛细管胶束电动色谱-紫外(MEKC-UV)技术筛查猪饲料、猪肝、猪肉和猪尿中的β2受体兴奋剂。考察了SDS浓度、缓冲液pH及浓度、毛细管温度等因素对五种β2受体兴奋剂分离和检测的影响。获得优化后的分离缓冲液为15 mM SDS、15 mM硼酸钠、pH=10、以及毛细管温度为25℃。在优化条件下,5种β2受体兴奋剂在18分钟内完成分离,在0.1-40μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系(R2>0.999),其检出限(S/N≥3)在0.05-0.08μg/mL范围之间。其中西马特罗、莱克多巴胺、克伦特罗具有较好的回收率(n=3)分别为95.8%,93.1%,95.0%,而沙丁胺醇和特布他林的回收率较低分别为52.3%和69.4%。被测物的峰面积和迁移时间的相对标准偏差分别小于4.86和1.25%。利用该方法对5种不同猪饲料、猪肝、猪肉和猪尿样品中的沙丁胺醇、特布他林、西马特罗、莱克多巴胺和克伦特罗进行了筛查。  4.分离后可调pH的微流控芯片电泳-电化学检测装置在氨基糖苷类抗生素分析中的应用研究  在理论计算与计算机模拟的指导下,我们开发了一种分离后可调pH的微流控芯片电泳-电化学检测装置用于氨基糖苷类抗生素的分析。该微流控芯片电泳装置可以同时实现氨基糖苷类抗生素在酸性缓冲溶液条件下(pH<5)的电泳分离和在碱性条件下(pH>12)的电化学测定。设计可以在电泳分离通道末端实现“柱后”加入碱性溶液的微流控芯片装置,以改变电极测定区域溶液的酸碱度,使其达到电化学方法检测糖类物质所要求的强碱性条件(pH=13)。此外,我们采用电沉积的方法将Cu-Cr-Sn过渡金属纳米材料修饰在Pt丝电极表面,提高了工作电极的稳定性和灵敏度,获得了高性能化学修饰电极,极大地提高了电极对氨基糖苷类抗生素测定的稳定性和灵敏度。在优化的实验条件下,我们建立了微芯片电泳与电化学检测装置分析牛血清中氨基糖苷类抗生素的方法,为临床上合理使用氨基糖苷类抗生素和有效监测动物源性食品中残留氨基糖苷类抗生素提供了一项可供参考的技术支持。
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