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前言Ghrelin是一种由28个氨基酸组成的多肽,主要来源于胃。以酰基化和非酰基化两种分子形式存在。Ghrelin是生长激素的内源性配体,能够刺激生长激素分泌和通过依赖生长激素增加摄食和减少脂肪利用,从而导致能量正平衡。Ghrelin还发挥多种外周作用,包括胰腺的外分泌和内分泌功能、糖代谢、心血管系统、胃的分泌作用和睡眠。Ghrelin通过抑制凋亡发挥对多种细胞的保护作用,如脂肪细胞、皮质神经细胞、胰岛β细胞、心肌细胞和内皮细胞。Ghrelin被证实能够与正常人和鼠的心血管组织结合,近期有许多关于ghrelin心血管作用的研究,但其细胞及分子机制不明确。有研究表明高心血管疾病风险的病理状态下,如单纯性肥胖、胰岛素抵抗、高血压病和2型糖尿病,其血浆ghrelin水平是的降低的。内皮细胞受损是糖尿病相关的动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)和心血管并发症发生的关键事件。细胞凋亡的增加与内皮受损及心血管疾病相关。游离脂肪酸参与导致内皮细胞功能失调、动脉粥样硬化及炎症反应。棕榈酸是体内含量最多的游离脂肪酸,研究表明棕榈酸能够增加体外培养的人血管内皮细胞凋亡及增加活性氧的生成。有研究表明,Ghrelin能够对多种外来刺激下的血管内皮细胞发挥保护作用,但是未见关于ghrelin对棕榈酸环境中内皮细胞的保护作用研究的报道。氧化应激参与绝大多数心血管疾病,氧化应激与抗氧化能力的失衡可能导致内皮细胞功能失调。许多存活因子通过活化特殊的信号通路抑制凋亡信号的级联反应。细胞磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B(Pphosphatidylinositol-3-kinase/Akt)参与调节细胞存活,已有研究表明该通路在ghrelin的保护机制中发挥重要作用,然而该信号通路在ghrelin的保护效应中的细胞内信号机制不明确。基于这些观察,我们设想ghrelin能够保护棕榈酸诱导的血管内皮细胞损伤。该实验中我们研究了棕榈酸对细胞增殖的影响和对棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响。因为氧化应激在凋亡中发挥重要作用,我们研究了ghrelin对棕榈酸诱导的活性氧生成的影响。因为Bcl-2通过与促凋亡的Bax蛋白结合起到抑制凋亡的作用,所以有理由相信Bcl-2与Bax的比率是决定细胞命运的一个重要因素。最后,我们研究了ghrelin对于Bcl-2与Bax蛋白比率的影响。材料与方法一、实验材料Wistar大鼠；胃饥饿素(Ghrelin),不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA),棕榈酸(PA), hoechst33258, MTT, PI3K/AKT阻断剂LY294002, ERK1/2阻断剂PD90859；实验使用的蛋白抗体有AKT及其第473位丝氨酸磷酸化一抗,Caspase3活性检测试剂盒；AnnexinV-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒。二、实验方法1、大鼠主动脉内皮细胞的原代、传代培养及鉴定雄性大鼠通过腹腔注射氨基甲酸乙酯麻醉,分离胸主动脉并将其浸入PBS中,用镊子迅速剥离脂肪或周围组织。纵行剪开主动脉,于血管内膜滴加0.1%Ⅰ型胶原酶,37℃消化30分钟。用剪刀将血管剪成大致2mm见方的小块,内膜朝下贴于6孔板中,滴加少许DMEM,将6孔板于37℃温箱中倒置约1小时,然后加入培养基,每3天换液。组织块周围细胞生长达80-90%融合时用0.25%胰酶消化,离心后接种于6孔板,每2-3天换液。细胞生长达90%融合时用0.25%胰酶消化传代。组织块或细胞培养过程中使用DMEM培养基,其中添加20%胎牛血清、1%青-链霉素、0.15mg/ml的内皮细胞生长添加物,于37℃含5%二氧化碳的培养箱中培养。第3-5传代细胞用于实验。通过其铺路石样形态及Ⅷ因子检测鉴定内皮细胞。2、MTT法检测细胞活性细胞接种于96孔板中,每孔含100μl培养液,加入20μl of MTT工作液(5mg/ml),37℃避光孵育4h,加入150μl二甲基亚砜(DMSO)。于570 nm下测定吸光度。3、Hoechst33258检测细胞凋亡将各组处理后的细胞用PBS洗2次,4%多聚甲醛固定10min,加100μl Hoechst33258染色,室温下放置10分钟,PBS洗2次后于荧光显微镜下观察。4、Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡将细胞洗涤、消化、重悬,行细胞计数,每管细胞含1×106个细胞。重悬细胞后加入160μl annexin V-FITC细胞结合液,室温避光孵育10min,收集细胞并重悬,加入190μl annexin V-FITC细胞结合液,加入碘化丙啶染色液,流式细胞仪检测。5、分光光度计检测caspase-3活性细胞用PBS洗2次,2000rpm/min离心5min,去除PBS,沉淀细胞中加入50μl冰冷裂解液和0.5μl DTT,冰上裂解60min,4℃10000rpm/min离心1min,加50μl 2x2×Reaction Buffer/DTTMix,加5μL caspase-3 substrate (Ac-DEVD-pNA),37℃4h。分光光度计在400nm波长测定其吸光值。6、细胞内活性氧检测应用DCFH-DA通过流式细胞仪检测细胞内活性氧,将细胞用无血清培养基洗二次,加入HBSS稀释的DCFH-DA(2μmol/L)荧光探针37℃继续孵育20min,培养结束后用冰PBS洗脱二次,收集细胞,流式细胞仪进行分析。7、Western blot分析磷酸化Akt、总Akt、Bax和Bcl-2用RIPA裂解液裂解细胞,提取蛋白质,进行10% SDS-PAGE, 1×TBS(pH 7.6)洗3次,转膜后5%脱脂奶粉封闭2h,加一抗4℃孵育过夜,加入辣根过氧化酶标记的二抗杂交2h,洗膜后ECL超敏发光液进行显色,结果用Scion Image分析软件对目的条带进行灰度值分析。8、统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行分析,结果用均数士标准差x表示,每组实验重复3次或3次以上,分析方法采用单因素方差分析,组间差异比较采用Dunnett’s检验,P<0.05差异有显著性。结果1、大鼠主动脉内皮细胞呈铺路石样生长,Ⅷ因子染色阳性。2、MTT检测结果显示ghrelin孵育细胞24h在加入或不加棕榈酸情况下均增加细胞活性(P<0.05)。3、Hoechst33258和Annexin V-FITC/PI双染结果显示,棕榈酸孵育细胞24h增加细胞凋亡(P<0.01), Ghrelin与棕榈酸共同孵育细胞较棕榈酸单独作用下细胞凋亡减少(P<0.01)。0.3mM棕榈酸孵育细胞24h显著增加caspase-3活性(P<0.01),Ghrelin与棕榈酸共同孵育细胞较棕榈酸单独作用下caspase-3降低(P<0.05)。4、Ghrelin (100nM)迅速增加Akt磷酸化,30min达高峰,至少持续60min。Ghrelin呈剂量依赖性活化Akt。PI3K抑制剂,LY294002抑制ghrelin诱导的Akt磷酸化(P<0.01)。Annexin V-FITC/PI双染结果显示,LY294002降低了ghrelin抑制棕榈酸诱导细胞凋亡的作用(P<0.01)。5、0.3 mM棕榈酸孵育细胞24h较对照组增加ROS生成(P<0.01),棕榈酸与ghrelin共同作用下ROS的生成较棕榈酸单独作用下减少(P<0.05)。6、0.3 mM棕榈酸孵育细胞24h降低了Bcl-2/Bax比率(P<0.01),ghrelin与棕榈酸共同作用下较棕榈酸单独作用下增加了Bcl-2/Bax比率(P<0.01)。结论1、0.3mM棕榈酸作用下增加细胞凋亡。2、Ghrelin抑制棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡。3、Ghrelin通过降低棕榈酸诱导的ROS生成增加起到细胞保护作用。4、Ghrelin诱导内皮细胞Akt磷酸化,PI3K阻断剂LY294002降低了ghrelin对棕榈酸诱导的细胞凋亡的抑制作用,提示ghrelin对细胞的保护作用至少是部分通过活化PI3K/Akt实现的。5、0.3 mM棕榈酸增加Bcl-2/Bax比率,ghrelin作用下增加Bcl-2/Bax比率。