【摘 要】
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乳腺癌是全球范围内女性最常见的癌症疾病,也是造成女性癌症死亡的一大原因之一,因此阐明乳腺癌发生发展的内在机制对其诊断和治疗尤为重要。ATP5B一般位于细胞内线粒体,而在乳腺癌细胞、前列腺癌细胞等多种肿瘤细胞中则更多的异位表达于细胞膜。Cav-1是小窝的主要组成部分,具有多种生物学作用。课题组前期实验发现Cav-1参与ATP5B调节的乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移侵袭。CK18（Cytoker
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乳腺癌是全球范围内女性最常见的癌症疾病,也是造成女性癌症死亡的一大原因之一,因此阐明乳腺癌发生发展的内在机制对其诊断和治疗尤为重要。ATP5B一般位于细胞内线粒体,而在乳腺癌细胞、前列腺癌细胞等多种肿瘤细胞中则更多的异位表达于细胞膜。Cav-1是小窝的主要组成部分,具有多种生物学作用。课题组前期实验发现Cav-1参与ATP5B调节的乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移侵袭。CK18（Cytokeratin 18）即细胞角蛋白18作为一类中间纤维蛋白,除参与细胞骨架组装外,也参与细胞内的信号通路转导等生物学过程。本研究旨在阐明乳腺癌MCF-7细胞及乳腺癌组织中ATP5B,Cav-1和CK18之间的关系:通过ATP5B的促进及抑制模型,Cav-1 sh RNA技术,免疫组织化学等方法探究CK18的表达是否受ATP5B/Cav-1调控,从而参与ATP5B/Cav-1调控的肿瘤细胞的迁移侵袭。方法:1、胆固醇刺激MCF-7细胞检测对ATP5B膜异位的影响,白皮杉醇孵育MCF-7细胞抑制ATP5B膜异位,进而通过western blot等方法检测ATP5B与CK18的关系。2、经sh RNA技术knock down Cav-1,通过western blot、PCR技术分别从蛋白和m RNA水平鉴定乳腺癌细胞MCF-7中Cav-1的knock down效果。通过western blot、CO-IP检测ATP5B/Cav-1对CK18的调控作用。3、通过免疫组织化学检测乳腺癌组织中ATP5B,Cav-1和CK18的表达,并通过统计学方法分析ATP5B,Cav-1和CK18与之间的关系。实验结果:1、胆固醇作用最终浓度20ug/ml,通过western blot检测胆固醇作用不同时间对质膜ATP5B异位表达的影响发现胆固醇刺激12h时ATP5B的膜异位最显著,所以将12h确定为最佳作用时间进行后续实验。白皮杉醇的作用浓度为10u M。Western blot检测发现胆固醇促进ATP5B膜异位表达,CK18表达上调,而白皮杉醇抑制ATP5B膜异位表达,CK18表达下调。2、通过sh RNA技术抑制MCF-7细胞中Cav-1的表达,PCR和western blot结果显示,与scramble组相比后,sh RNA组的Cav-1在m RNA水平和蛋白水平表达均下调。同时与scramble组相比,sh RNA组的CK18蛋白水平表达下调,而胆固醇刺激后与scramble组相比,sh RNA组的Cav-1和CK18的蛋白表达水平无显著变化。3、通过免疫组织化学检测ATP5B,Cav-1和CK18在乳腺癌组织中的表达发现:在14例乳腺癌组织中ATP5B均呈细胞膜阳性表达,其中低表达阳性率50.00%,高表达阳性率50.00%;在17例乳腺癌组织中Cav-1阳性表达率88.24%;在29例乳腺癌组织中CK18均呈阳性表达,其中低表达阳性率37.93%,高表达阳性率62.07%。通过统计学方法分别分析ATP5B,Cav-1和CK18与临床病理特征的关系发现ATP5B及Cav-1的表达与患者年龄,肿瘤大小,肿瘤的转移以及TNM分期无显著相关性;患者的肿瘤大小与CK18的表达升高有关（P<0.05）,而患者年龄,肿瘤的转移及TNM分期与CK18表达无显著相关性。通过统计学分析Cav-1和CK18的临床相关性发现两者具有相关性。结论:通过上述实验得出以下结论,在MCF-7细胞中ATP5B,Cav-1和CK18的表达具有相关性,质膜异位ATP5B可以影响CK18表达,Cav-1调控CK18的表达。在通过胆固醇刺激ATP5B膜异位过表达时CK18表达升高,而在抑制表达后CK18的表达下降;通过Cav-1 sh RNA knock down Cav-1时CK18的表达下降,而这一表现不能通过胆固醇扭转。ATP5B和Cav-1在MCF-7细胞表面形成聚合体并发挥生物学功能。体内实验验证ATP5B异位表达于乳腺癌细胞表面,ATP5B,Cav-1和CK18表达具有相关性。
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