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谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是一种重要的非蛋白巯基三肽,普遍存在于自然界中,具有重要的生理活性功能,在食品、医药、化妆品等领域广泛应用,目前GSH的工业生产主要是微生物发酵生产。本文首先建立及优化了发酵液中GSH快速检测方法,提高诱变后突变株的筛选效率;并采用常压室温等离子体及化学诱变剂处理酵母细胞,并结合ZnCl2抗性筛选,获得高产突变株D-17-51;最后通过表面活性剂的优化提高细胞膜透性,进一步提高了发酵产量。主要研究内容和结果如下:(1)GSH快速检测方法的建立与优化。为快速测定发酵液中GSH的含量,基于DTNB比色反应,采用酶标仪法测定GSH含量,并对影响该方法主要因素进行了优化。在GSH测定的反应体系为0.25 mol/L Tris-HCl(pH8.0)0.6 mL,3%甲醛0.1 mL,0.1 mmol/L DTNB为1.5 mL时,酶标仪检测可获得较高的GSH含量,并进行了精密度实验。最后,对诱变的45株突变株采用48孔板发酵后,分别使用酶标仪和分光光度计对发酵液中GSH含量进行检测及拟合度分析,得出酶标仪法和分光光度计法的相关系数R2=0.93082,说明两种检测方法具有很好的一致性。本实验结果表明酶标仪法能操作快速、简便、准确的测定发酵液中的GSH含量,为后续快速筛选高产GSH菌株奠定了实验基础。(2)复合诱变选育高产GSH菌。以菌株D作为出发菌株,采用常压室温等离子(ARTP)进行诱变处理,在平板上涂布培养后,随机挑选37株突变株,分别经摇瓶和24孔板发酵培养,采用酶标仪法测定发酵液中GSH的含量。结果显示摇瓶和24孔板发酵培养的测定结果具有很好的一致性,两种方法之间的相关系数R2为0.97653,表明24 板可代替传统的摇瓶发酵,快速从大量的突变株中筛选出高产GSH突变株,提高筛选效率。以D菌株作为出发菌株,分别使用ARTP、紫外(UV)、化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)与硫酸二乙酯(DES)进行诱变处理,筛选结果发现ARTP与EMS复合诱变效果最好,即120 s为最佳诱变时间的ARTP处理后冰浴2h,再使用0.3%的EMS处理2.5 h,获得产量最高的突变菌株D-17-51,24孔板发酵产量达到359.67 mg/L,较出发菌株提高了194.8%。对突变株D-17-51进行遗传稳定性试验,经5次传代后产量下降不大,比较稳定。(3)表面活性剂对突变株D-17-51胞外分泌GSH特性的影响。表面活性剂因其独特的分子结构——既有亲水端又有亲脂端,与细胞膜的结构类似,可用来增加细胞膜的通透性。考察了四种表面活性剂,发现阴离子型表面活性剂SDS对GSH胞外积累有积极作用,随着SDS的增加细胞干重下降,胞外GSH含量不断上升。当SDS的浓度达到2 g/L时,胞外分泌量最多,接近总产量;而当SDS的浓度为4 g/L细胞浓度减少、合成GSH的能力下降,而且发酵结束时细胞存在量很少。在发酵过程中添加终浓度为2 g/L的SDS,得到如下结果:在发酵Oh和8 h添加SDS,随着时间增长,细胞增长缓慢,没有促进GSH外排;发酵16 h和24 h添加SDS时,细胞进入稳定期,合成GSH量增加且大量向胞外分泌;而在发酵32 h和40 h添加SDS对GSH的合成没有太大影响,可以促进GSH胞外分泌但量不大。