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目的:优化叶酸壳聚糖川芎嗪纳米粒(主动靶向纳米粒,FA-CS-LZ-NPs)的制备工艺,考察其体内外靶向特征,探讨其抑制肿瘤转移作用与机制。方法:1.主动靶向纳米粒制备和处方、工艺优化。离子交联法制备主动靶向纳米粒,选取叶酸壳聚糖(FA-CS)浓度、多聚磷酸钠(TPP)浓度、p H值为主要影响因素,以包封率、载药量、粒径作为评价指标,采用Box-Behnken实验设计对纳米粒处方和工艺进行优化。2.主动靶向纳米粒体外靶向性考察。Western Blotting法检测细胞叶酸受体表达水平,筛选细胞用于下一步试验。MTT法检测主动靶向纳米粒的细胞毒性,确定给药剂量。取Bel7402细胞(叶酸受体高表达)分别给予主动靶向纳米粒(FA-CS-LZ-NPs)、被动纳米粒(CS-LZ-NPs)和川芎嗪溶液(LZ),另取L-02(叶酸受体低表达)给予FA-CS-LZ-NPs,HPLC法检测不同时间内细胞对LZ的摄取。FA-CS-LZ-NPs作用于三种叶酸受体表达水平不同的细胞,4h后,HPLC法检测各组细胞内LZ的浓度。3.主动靶向纳米粒体内靶向性考察。异硫氰酸荧光素(FITC)标记FA-CS,红外光谱、核磁共振光谱分析产物的结构表征。荧光素标记主动纳米粒(FITC-FA-CS-NPs)和被动纳米粒(FITC-CS-NPs),H22荷瘤小鼠尾静脉分别注射上述两种标记药物和FITC溶液后,于30min后活体荧光成像,随即小鼠离体组织荧光成像。另取,H22荷瘤小鼠分别尾静脉给予FA-CS-LZ-NPs、CS-LZ-NPs和LZ,HPLC法分析在不同时间点小鼠血浆与组织内川芎嗪药物浓度。4.主动靶向纳米粒抑制肿瘤转移的研究。建立小鼠H22肿瘤转移模型,随机分为8组,分别给予:FA-CS-LZ-NPs(40mg/kg,高剂量)、(20mg/kg,中剂量)、(10mg/kg,低剂量),CS-LZ-NPs(20mg/kg),LZ(20mg/kg),主动空纳米粒(FA-CS-NPs),5-FU(20mg/kg),生理盐水(0.2m L)。连续给药21天,比较各组小鼠体重变化,免疫组织化学检测移植瘤中MMP-9、VEGF的蛋白表达水平,比较各组小鼠肺转移结节数。结果:1.按照优化处方(1mg/m L FA-CS,0.89mg/m L TPP,p H4.61)制备FA-CS-LZ-NPs,该纳米粒的包封率为(36.72±0.65)%,载药量为(9.44±0.17)%,粒径为141.1±0.6 nm,分散度(PDI)为0.219±0.011,Zeta电位为20.8±1.4 mv,可知实验观察值和模型预测值都比较接近,模型预测性良好。2.Western Boltting测得Bel7402、L-02细胞叶酸表达水平具有显著性差异,可用于后续试验。主动靶向纳米粒对Bel7402、L-02细胞的无毒剂量是LZ 47.5μg·m L-1。Bel7402和L-02细胞给药4h后,胞内川芎嗪浓度达到饱和,而且FA-CS-LZ-NPs组Bel7402细胞内LZ药物浓度显著高于CS-LZ-NPs组、LZ溶液组以及L-02细胞FA-CS-LZ-NPs组。说明叶酸修饰的纳米粒促进了Bel7402对药物的摄取。Hela、Bel7402、L-02三种细胞分别给予FA-CS-LZ-NPs处理,经HPLC检测细胞内川芎嗪浓度由高到低依次为Hela>Bel7402>L-02,证明细胞内药物摄取量与细胞叶酸受体表达水平成正相关。3.FITC-FA-CS与FA-CS相比,红外图谱中,在1575cm-1处弯曲振动增强,是壳聚糖的氨基与FITC的异硫氰根反应的结果;核磁氢谱图中,δ6.715,δ6.949ppm处新增两个位移值,为FITC芳烃质子峰,证明FITC偶联到叶酸壳聚糖骨架上。活体成像观察发现,与注射FITC-CS-NPs和FITC溶液相比,注射FITC-FA-CS-NPs荷瘤小鼠肿瘤部位的荧光强度要强。离体脏器成像和体内LZ药物分布结果显示,主动纳米粒组在肿瘤组织的分布显著高于被动纳米粒组、溶液组。经过叶酸修饰的纳米粒主要集中在肿瘤、肝、肾部位,而未经叶酸修饰的纳米粒主要集中在肝、肺部位,溶液组中组织分布较少。4.5-FU组小鼠体重呈下降趋势,其他给药组均有不同程度增长,表明川芎嗪纳米粒毒副作用小。MMP-9、VEGF蛋白表达水平呈剂量依赖性下调,且主动靶向纳米粒抑制效果较好。FA-CS-LZ-NPs与CS-LZ-NPs、LZ溶液相比,抑制肺部转移瘤效果更好,呈剂量依赖性。结论:本实验优化制备出的叶酸壳聚糖川芎嗪纳米粒粒径较小,包封率和载药量较高。体外实验表明此制剂对叶酸受体高表达的Bel7402细胞具有靶向性。体内实验表明该制剂对叶酸受体高表达的H22肿瘤模型靶向效果良好。与被动纳米粒组、川芎嗪溶液组相比较,主动靶向纳米粒对H22转移模型具有更好的抑制肿瘤转移作用,这一作用可能是通过下调MMP-9、VEGF表达水平实现的。