论文部分内容阅读
已有大量的研究表明,胎儿的生长发育和生理状况与母体营养水平及胎盘养分转运能力密切相关,附植于子宫不同位点的胎儿体重及其对应的胎盘结构和养分转运能力也存在显著的差异。已有研究证实,miR-17-5p具有抑制细胞及组织生长的作用,而circRNAs则可与miRNAs结合后抑制其活性,进而调控其靶基因的表达。然而,关于circRNAs和miRNAs对宫内胎儿生长发育的调控机制、营养与非编码RNA的互作方面的研究还很少。因此,我们假设能量水平可以通过调节胎盘-胎儿circ-Amotll及miR-17-5p的表达来调控相关印迹基因和养分转运基因的转录,进而对胎儿生长发育产生影响。主要研究内容及结果如下:试验一能量水平对猪胎盘养分转运和胎儿发育的影响本试验采用单因子设计,分别选取体重和日龄相近的大约克初产母猪(135.74±0.88kg,255±11d)42头。配种成功后,将母猪按体重和背膘厚随机分到2个处理组中(高能组:3.4Mcal/kg,HE;低能组:3.0Mcal/kg,LE),每组21个重复,每个重复1头猪。在妊娠35d,55d,90d及110d,每个处理选取8头猪采血、称重、测背膘厚。妊娠35d,55d,90d从每个处理组中选择4头母猪麻醉后屠宰,取出所有胎儿及其对应的胎盘,称重;分娩0d,从每个处理组中选择6头母猪,收集平均体重的胎儿及其对应的胎盘。收集平均体重的胎儿脐带血、肝脏及其对应的胎盘组织样品用于后续测定。通过ELISA技术检测血液中激素变化。通过RT-PCR技术检测胎盘和胎儿肝脏中养分转运相关的基因及非编码RNAs的表达。试验结果如下:1.与LE组相比,HE组妊娠55d、90d和110d的母体重显著提高(P<0.05),35d两组间差异不显著(P>0.05);妊娠90d和分娩时母猪背膘厚、胎盘重及胎儿重量显著提高(P<0.05),35d和55d两组间差异不显著(P>0.05)。2.HE日粮显著提高了妊娠90d和110d母猪血清中葡萄糖、甘油三酯、游离脂肪酸及瘦素含量(P<0.05),但妊娠35d和55d,两组间不存在显著差异(P>0.05)。日粮处理对妊娠各阶段血清总胆固醇和糖皮质激素的影响差异均不显著(P>0.05)。3.与LE组相比,HE组妊娠90d和分娩时胎盘组织中circ-Amotll的表达量显著提高(P<0.05),而miR-17-5p的表达量显著下降(P<0.05);妊娠35d和55d,两组间差异不显著(P>0.05)。4.HE日粮显著提高了妊娠90d和110d胎盘和胎儿肝脏中IGF-2、Stat3、葡萄糖转运载体基因Slc2a3、脂肪酸转运载体SLC27A1及Dnmt3a的表达量(P<0.05),下调了 H19 的表达(P<0.05)。本试验结果表明,母体妊娠期HE日粮促进了妊娠后期胎盘养分转运能力,加快了胎儿宫内生长速度。HE日粮促进胎儿发育及上调胎盘养分转运能力的机制可能与circ-Amotll和miR-17-5p的表观调控及Stat3信号通路有关。试验二能量水平对子宫内附植不同位点胎盘蛋白组学差异及circ-Amotll 的影响试验一中的结果表明HE日粮提高了妊娠后期胎盘的养分转运能力及胎儿的生长,并且不同处理组中circ-Amotll和miR-17-5p的表达水平也有显著差异。已有研究报道,子宫不同附植位点的胎儿体重存在明显的差异,但营养特别是能量水平对不同附植位点胎儿发育的影响及其机制还不清楚。因此,我们开展了试验二。试验处理及饲养管理同试验一。妊娠35d、55d和90d,HE组和LE组分别随机选取4头母猪深度麻醉后屠宰,腹部手术后,将整个子宫取出置于冰上。妊娠90d,收集子宫颈至子宫角末端的每个胎儿对应的脐静脉血。妊娠35d、55d、90d和分娩Od,称量并记录每个胎儿的重量,分离出每个胎儿对应的胎盘,称重,距离脐带5 cm处,收集胎盘样品。妊娠90d,分别收集HE组子宫颈位置、HE组子宫角末端位置、LE组子宫颈位置和LE组子宫角末端位置的胎盘样品。运用iTRAQ和MRM方法分析相关蛋白组学指标,RT-PCR技术检测circ-Amotll和miR-17-5p的表达情况。具体结果如下:1.妊娠35和55d,妊娠期母体能量处理对窝内胎儿的体重变异系数及胎儿胎盘重量均没有显著影响(P>0.05)。对妊娠90d和分娩的结果分析发现,妊娠90d及分娩时,HE组窝内重量变异系数显著的低于LE组(P<0.05)。2.妊娠90d,LE组子宫角末端中胎儿葡萄糖和FFA浓度均显著的高于子宫颈(P<0.05),但HE组中不存在显著差异(P>0.05)。3.使用iTRAQ分别对LE组不同位点样品中3011种和HE组中3018种蛋白进行分析发现:LE组中,有78种蛋白在子宫角末端和子宫颈胎儿间的表达差异大于1.2倍(P<0.05),其中36种蛋白上调,42种蛋白下调。这些差异表达的蛋白与脂质、能量、氨基酸等养分转运和代谢密切相关。进一步分析发现,与养分转运和代谢相关的蛋白占总差异表达蛋白的绝大部分比重(约62.3%)。其中,与脂质转运和代谢相关的又占据主导地位(18.90%)。在HE组中,有50种蛋白在子宫角末端和子宫颈胎儿间的表达差异大于1.20倍(P<0.05),其中27种蛋白上调,23种蛋白下调。尽管差异蛋白也与养分转运和代谢相关,但它们的比重仅有35.60%。与脂质转运和代谢相关的蛋白又只占这些差异蛋白总量的6.50%。进一步分析发现,能量水平和附植位点对胎盘组织中GLUT和SLC27A表达的影响间存在显著的交互作用(P<0.05)。即对低能量处理组的胎盘中,子宫角末端表达GLUT及SLC27A显著的高于子宫颈,而HE组中,不同位点对这两种蛋白表达的影响却不存在互作效应。4.妊娠90d,两组子宫角末端中胎盘组织中circ-Amotll的表达量均显著的高于子宫颈(P<0.05),miR-17-5p的结果与之相反。本试验结果表明,提高日粮能量水平可以通过降低子宫颈和子宫末端胎盘中差异表达蛋白的数量,特别是与养分转运和代谢相关的蛋白数量来调控胎儿重量。母体妊娠期饲喂高能日粮导致CVBW降低。Circ-Amotll的表达可以影响不同体重及位点的胎儿发育及对应胎盘的养分转运能力。试验三circ-Amotll对细胞和组织生长的调控及分子机制试验一和试验二的结果表明,circ-Amotll和miR-17-5p可以影响胎盘养分转运及胎儿发育,但具体的作用机理还需要进一步研究。因此,我们开展了试验三。细胞培养试验:以小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)为模型分别转染空质粒(vector)、circ-Amotll、Stat3、si-Stat3、si-Dnmt3a和miR-17-5p等质粒,考察它们对细胞生长的影响及其具体作用机理。动物试验:采用单因子设计,选取4周龄、体重相近的C57BL/6小鼠30只,随机分配到2个处理组中:对照组,空质粒-纳米颗粒复合物;试验组,circ-Amotll-纳米颗粒复合物。每间隔1天,腹腔注射150 μg/kg质粒-纳米颗粒复合物,试验周期为28天。第28天,麻醉后屠宰,取肝脏、心脏、肾脏、胰腺,测定相关指标。结果表明:1.高能量水平提高了细胞中circ-Amotll的表达,并且促进了细胞的增殖、存活、粘附和迁移。2.circ-Amotll过表达增加了细胞增殖、存活、粘附和迁移的能力,促进细胞生长。3.通过RT-PCR、Western blotting、荧光素酶报告分析、免疫荧光染色及原位杂交试验发现,circ-Amotll通过提高Stat3的核转位能力来增强细胞活力。转移到细胞核中的Stat3能够连接Dnmt3a的启动子,促进Dnmt3a的转录和翻译。Dnmt3a诱导了 miR-17启动子的甲基化,降低了 miR-17-5p的表达,IGF-2表达上调。4.动物试验结果表明,circ-Amotll过表达后,小鼠生长速度加快。进一步分析发现,过表达组小鼠肝脏组织中Stat3、Dnmt3a、IGF-2的表达量随着circ-Amotll表达量的升高而增加,而miR-17-5p和H19的表达量显著降低。本试验结果说明,circ-Amotll与Stat3结合后促进Stat3的核转位,Stat3核转位后上调了 Dnmt3a的表达水平,下调miR-17-5p的表达水平;而miR-17-5p表达上调则能够抑制Stat3的表达,导致circ-Amotll功能下调。Circ-Amotll和miR-17-5p之间的反馈调节共同调控细胞及动物的生长。综上所述,本论文主要结论如下:(1)能量水平通过影响circ-Amotll和miR-17-5p的表达调控妊娠后期胎盘养分转运和胎儿宫内发育。(2)能量水平通过调节子宫颈和子宫末端胎盘中差异表达蛋白的数量,特别是与养分转运和代谢相关的蛋白数量来调控胎儿发育及CVBW;非编码RNA的表达可以影响不同附植位点胎儿发育及对应胎盘的养分转运。(3)Circ-Amotll可通过抑制miR-17-5p的表达促进细胞及组织的生长。