论文部分内容阅读
第一部分UVA对人皮肤成纤维细胞凋亡的影响目的:提取、培养、鉴定原代人皮肤成纤维细胞,获得足够的细胞源。从形态学观察不同剂量长波紫外线（UVA）对原代人皮肤成纤维细胞生长的影响,分析照射后成纤维细胞增殖活性随UVA剂量变化的关系,探讨UVA对原代人皮肤成纤维细胞凋亡的影响以及摸索UVA诱导原代人皮肤成纤维细胞凋亡的最佳剂量与时间。方法:1.收集2-14岁男性包皮环切术后的包皮,消毒后,将包皮分离,取真皮层;剪碎成糜状,加入胶原酶消化,离心后弃上清,用完全培养基（含87%高糖DMEM、10%FBS、1%GlutaMAX、1%NEAA、1%青霉素-链霉素溶液）重悬后,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。将细胞进行免疫细胞化学法鉴定,获得了高纯度的细胞源。进行不断的传代,冻存细胞。直接计数法观察细胞的生长情况。2.建立UVA照射成纤维细胞模型,观察细胞形态。细胞以1.5×105 cells/ml密度均匀地接种于6孔板中,待细胞融合度为80%时于SUV-1000日光紫外线模拟器光束下进行照光,设有未照光的对照组、4 J/cm2组、8 J/cm2组、12 J/cm2组、16 J/cm2组、20 J/cm2组、40 J/cm2组、80 J/cm2组,照射后细胞继续放入培养箱中培养,在显微镜下观察不同的时间点细胞的生长变化,并照相记录。3.不同剂量UVA照射后,设有5组:对照组、4J/cm2组、8 J/cm2组、12 J/cm2组、16 J/cm2组,每种剂量设有3个复孔,将细胞继续培养4h加入20ul MTT,150ul DMSO,用酶标仪在490 nm下检测各孔吸光度OD值。4.细胞凋亡的检测设置有5组:对照组、4 J/cm2组、8 J/cm2组、12 J/cm2组、16 J/cm2组。UVA照光后培养4h,加入Binding Buffer、5ul Annexin V-FITC和5ul PI在流式细胞仪下进行检测。结果:1.人皮肤成纤维细胞1-2天贴壁生长,呈纺锤形或者梭形,细胞鉴定发现波形蛋白染色为阳性,经过培养的原代细胞符合人皮肤成纤维细胞的特征。直接计数法发现第3-5天细胞增殖速度较快,处于对数期;第6-7天细胞融合度达80%,生长速度缓慢,处于平台期。2.随着UVA剂量的增加,UVA对人皮肤成纤维细胞的损伤增大,呈剂量依赖关系:照射剂量越大,胞内颗粒增多,细胞皱缩变圆,细胞排列间隙增大,胞质折光性下降。UVA照射成纤维细胞后4h的细胞形态变化较大。3.照射剂量≥8 J/cm2,随着照射剂量的增加细胞增殖活性下降,与对照组相比,有显著性差异（P<0.01）;除对照组与4 J/cm2组差异无统计学意义（P>0.05）,其余各组之间有显著差异（F=219.01,P<0.01）。当UVA的剂量为8 J/cm2时,细胞增殖活性大于85%且细胞状态良好。4.随着UVA照射剂量的增加,成纤维细胞凋亡率逐渐增加。除对照组与4 J/cm2组差异无统计学意义（P>0.05）,12 J/cm2组与16 J/cm2组差异有统计学意义（P<0.05）,其余各组之间具有显著差异（F=106.61,P<0.01）。照射剂量≥8 J/cm2,与对照组相比,有显著性差异（P<0.01）。结论:1.UVA照射可导致原代人皮肤成纤维细胞形态发生变化,呈剂量依赖性。2.UVA照射原代人皮肤成纤维细胞后,细胞增殖活性受到抑制,UVA剂量越大,活性下降越明显。3.UVA可诱导原代人皮肤成纤维细胞凋亡,细胞凋亡率随UVA强度的增大而升高。第二部分细胞自噬对UVA致人皮肤成纤维细胞凋亡的影响目的:观察自噬诱导剂RAPA和抑制剂3-MA对UVA照射原代人皮肤成纤维细胞后细胞活性的改变;明确UVA照射后,自噬与UVA致成纤维细胞凋亡的关系。方法:1.实验分为对照组、RAPA组、3-MA组。照光前加入100 nmol/L RAPA和50 umol/L 3-MA预先孵育2h,8 J/cm2UVA照射成纤维细胞后继续培养4h,观察细胞形态。2.将细胞接种在96孔板上,每孔约5000个细胞。RAPA组、对照组、3-MA组,每种剂量设有3个复孔,2天后将96孔板置于紫外线模拟器下照光,培养4h后用MTT法检测上述三组的细胞活性。3.按照第一部分类似的方法用流式细胞术检测上述三组细胞凋亡情况。结果:1.形态学观察各组成纤维细胞形态:RAPA组最好,对照组次之,3-MA组最差。2.干预后,细胞活性从高到低的顺序依次是RAPA组、对照组、3-MA组;RAPA组和3-MA组分别与对照组比较,具有统计学意义（P<0.05）;组间有显著性差异（F=23.86,P<0.01）。3.干预后,细胞凋亡率从高到低的顺序依次是3-MA组、对照组、RAPA组,各组之间具有显著性差异（F=43.70,P<0.01）。结论:1.细胞自噬对UVA照射原代人皮肤成纤维细胞有保护作用,促进自噬可保护细胞形态,提高细胞活性。2.细胞自噬可抑制UVA照射后原代人皮肤成纤维细胞凋亡。抑制自噬,可促进UVA照射后原代人皮肤成纤维细胞凋亡。