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随着人口和人类需求的不断增长,以陆生生物来源的多糖类等生物活性物质的开发逐渐呈难以为继之势。海洋中蕴藏着极其丰富的天然产物,是人类寻找新的生物活性物质的最大库源,因此,海洋生物活性物质的研究开始备受关注。海洋动植物活性物质的真正生物源是海洋微生物,特殊的生活环境,使得海洋微生物具有显著的特性,集中体现在机体内含有许多结构特殊的生物活性物质和代谢产物。其中一些生物物质,虽然具有独特的生物活性,但是它们能够蓄积在海洋生物中,比如鱼、贝类体内,通过食物链传播给人类,造成人的食物中毒。因此,在合理开发利用海洋资源的同时,有必要对这类产毒素食源微生物进行深入研究。
本文以海洋亚历山大藻和副溶血弧菌作为研究对象,主要针对亚历山大藻麻痹性贝毒素的产生与藻自身遗传物质之间的关系、亚历山大藻产毒特性的遗传差异以及相关产毒基因等问题进行研究,并建立了恒温核酸扩增体系实现了对产毒亚历山大藻和非可培养状态下副溶血弧菌的特异性检测,以期为深入开发利用海洋生物资源过程中所引起的安全问题提供了理论研究基础和技术支持。主要研究内容和结果如下：
1、研究了亚历山大藻细胞在活体和乙醇固定状态下DNA的提取方法,并考察了固定剂乙醇的固定浓度、时间、温度等因素对固定细胞DNA降解率的影响。结果表明：冻融-CTAB方法提取的亚历山大藻细胞DNA纯度和得率较高,OD260 nm/OD280 nm的值基本都在1.75～1.90区间内,蛋白污染很少,OD260 nm/OD230 nm的平均值也都在1.96以上。乙醇的最佳固定浓度在5％,长期固定藻细胞应放置在-80℃,短期使用可放置4℃并尽量缩短放置时间。
2、对亚历山大藻株核糖体DNA的分子特征进行了分析,并且对亚历山大藻的产毒特性进行了遗传差异分析,结果表明：无毒藻株在5.8S rDNA-ITS核糖体区间与有毒株系差异较大,核苷酸差异值达到0.391,而无毒藻株之间核苷酸差异值较小,达到0.003。在分子生物学水平上证明了有毒株与无毒株在核糖体DNA序列上存在显著遗传差异；通过脉冲场凝胶电泳实验,在基因组水平上证明,亚历山大藻毒素的产生与自身基因组(遗传物质)有密切的关系；通过PCR-RFLP酶切图谱特征可以准确地将不同亚历山大藻种的产毒类型区分开,为麻痹性贝毒素的组分鉴定提供了一条新途径。
3、根据核糖体DNA在有毒藻与无毒藻之间的序列差异,以核糖体DNA为靶序列,设计有毒藻种特异性简并核酸扩增引物,建立新型恒温核酸扩增方法(LAMP),实现对有毒藻种的快速检测。结果表明:LAMP方法在65℃恒温条件下1h就完成对目标有毒藻种的检测。检测过程发现,LAMP扩增是非常特异性的,共存于同一体现中大量外源DNA并不影响扩增结果和效率；LAMP方法具有很高的灵敏度,最低可以检测到5个单细胞,是PCR灵敏度的10倍；通过添加荧光染料SYBR Green Ⅰ,阳性结果的绿色很明显区别于阴性结果橙色,灵敏度与凝胶电泳结果一致。
4、构建了微小亚历山大藻产毒株基因组文库。通过插入片段与载体的连接、转化以及平板筛选,获得1014bp大小的特异性重组片段,PCR验证该片段在有毒株中有强烈的扩增信号,而在无毒株中无扩增信号。利用反向PCR方法分析特异性片段旁侧DNA序列信息,获得其中一段240bp大小的核苷酸序列,其对应氨基酸序列翻译的对象是甲硫氨酰氨肽酶(MAP),氨基酸比对分析,其与芬地亚历山大藻MAP的氨基酸序列相似性达到97％。研究发现,这条核苷酸序列与已报道的序列在编码区完全相同,但是在终止密码子之外的非编码区突变了三个碱基,推测是由于微小亚历山大藻在生长代谢过程中,MAP执行了不同的生理功能需求,在转录水平上对毒素的产生进行了调控,map基因通过其编码产物对其他产毒相关基因进行了诱导,使其具有活性表达,开始毒素合成。
5、针对副溶血弧菌在低温和贫营养条件下不能增殖因而造成漏检的问题,建立了原位荧光恒温核酸扩增方法(in situ LAMP),实现毒素基因在恒温65℃条件下单细胞内原位大量扩增。结果表明：较低的反应温度减轻了对细胞结构的损坏,细胞完整固定在载玻片上,无脱落现象,获得的图像背景对比度很强；检测副溶血弧菌与溶藻弧菌的混合菌时,通过蓝光的激发,标记有荧光信号的副溶血弧菌被特异性检测出来；检测人工模拟污染样品时,检测结果没有受到杂质的影响,倒置荧光显微镜下可以检到单个细胞；通过与PCR方法和LAMP方法做比较,发现,原位荧光LAMP方法在检测48份副溶血弧菌样本时效果非常显著的,检测率在96％以上,灵敏度和特异性与LAMP方法相当,但是,它的检测限可以达到单个细胞并且可以更直观的观察到细胞存在状态。