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植物有性生殖过程涉及多个不同发育阶段,其中包括配子体发育、受精作用、胚胎发育等。拟南芥SUMO E3酶SIZ1参与植物的多个发育过程,同时在抗逆领域发挥着极为重要的作用。SIZ1缺失突变体植株中积累大量的水杨酸。本文主要对SHZ1在拟南芥有性生殖过程中的影响进行了研究。主要研究内容如下：
⑴通过检测Prosiz1:GUS—GFP融合表达载体转化野生型,获得的单拷贝插入转基因植株。对转基因植株花器官进行GUS染色和GFP信号观察,发现GUS信号几乎在各个时期的花朵中均能检测到,除了最新分化来的少数几个小花苞。每朵花中GUS信号最强的组织是花萼。另外,花辦和雌蕊也有强烈的GUS着色反应。雄蕊和花粉粒上未检测到明显的GUS信号。在雌蕊内部,整个胚珠都检测到GUS信号。而对GFP检测到的结果也与GUS信号检测结果相吻合。
⑵siz1突变体角果短小,具有一部分与野生型相似的发育良好的种子,同时还具有23.3％的干瘪种子。将SIZ1基因转入siz1-2突变体可以恢复种子败育的表型。但是水杨酸含量降低的nahG siz1-2植株中的种子发育表型则与siz1-2相似(具有20.7％的干瘪种子)。通过相差显微镜对受精前后的siz1-2和野生型胚珠进行观察比较,发现siz1-2败育胚珠停留生长,大小在100um左右,且无胚晶。而受精后的胚珠与野生型胚珠相比无异常,表明SIZ1缺失突变不影响胚胎的发育。
⑶花粉体外培养实验的结果显示:siz1-2突变体花粉与野生型花粉具有萌发率分别是78％和82％。两者花粉管的生长速度和形态也未发现有明显差异。野生型与siz1-2突变体正反交实验显示:siz1-2突变体花粉给野生型雌蕊授粉能得到胚珠长满的角果。相反的,野生型花粉给siz1-2突变体雌蕊授粉时产生短小的角果,其中有21.3％的缺陷胚珠,与siz1-2突变体自交的情况相似.以上两个实验结果表明SIZ1对花粉没有影响。
⑷在siz1-2突变体的雌蕊中,当花粉管在柱头上萌发后,可顺利通过柱头、花柱及花粉管通道,这与野生型雌蕊中的情况相似；但是,当花粉管从花粉管通道的隔膜长出后,花粉管的行为与在野生型雌蕊不同,表现为部分胚珠中并无花粉管进入珠孔。为了检测siz1-2突变体中花粉管导向相关蛋白的表达是否受到SIZ1蛋白缺失的影响,利用siz1-2和野生型植株中花期12c雌蕊的总RNA样品制备cDNA,并进行实时荧光定量PCR检测。结果显示,与野生型植株相比,在受检测的相关基因中,包括CCG,MAA3,MYB98,PDI1和POP2等在siz1-2突变体中的表达量均无明显变化。
⑸激光共聚焦显微镜观测siz1-2突变体胚珠发育,结果显示:从FG1-FG7发育时期,siz1-2突变体雌蕊中胚珠都发育正常,胚囊及配子体的细胞核清晰可见,与野生型胚珠无明显差异。在去雄后两天的siz1-2雌蕊中,在585个受测的胚珠中,近80％的胚珠仍包含完好的胚囊,且形态结构并无异常。然而此时还有一部分胚珠(21.2％)的雌配体细胞已发生降解。实时荧光定量PCR表明,影响雌配体发育的相关蛋白基因的表达在siz1-2和野生型植株花期12c的雌蕊中尚无明显差异。综上所述,我们推测,由于siz1-2中部分成熟胚珠降解使花粉管的导向出现问题,最终导致种子的减产,而siz1-2突变体植株中高水平的水杨酸含量与上述现象似乎关系不大。