牛疱疹病毒1型LAMP检测方法的建立和应用

• 作 者: 郭兴国
• 出 处: 南阳师范学院
• 发表日期: 2016年01期
• 关键词: 牛传染性鼻气管炎病毒 环介导等温扩增技术 条件优化 应用

牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus 1, BHV-1)又称为牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus, IBRV),是目前对养牛业影响十分严重的病原之一,该病在世界范围内流行。牛群被此病毒感染后会引发一系列的临床症状,呼吸困难、上呼吸道及气管、黏膜发炎,同时还可引起母畜和公畜生殖系统炎症及小牛脑膜炎等。特别是在该病毒感染后可潜伏于机体的某一组织部位,从而导致持续性感染和长期甚至终生带毒,给整个牛群造成巨大的影响和损失。目前,在全国范围内又陆续报道了该病的感染和流行。国内市场上尚没有相关的疫苗和诊断试剂。由于国内还没有商品化的疫苗,实施生产过程中主要通过监测病毒的持续性感染、净化牛群,以此达到控制该病的目的。而传统的病毒分离技术、PCR技术和免疫荧光检测技术等,往往存在耗费时间长,投入成本较高或者需要十分精密的检测仪器等因素,制约了在现场的检测及应用。而环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)具有灵敏度高、特异性高、操作简单、对仪器设备要求低等优势,结果的判定也简单易行,适用于基层的快速诊断。本研究参考已发表的相关文献,通过比对Genebank上BHV-1的全基因组序列,选择保守区域,利用在线软件Primer Explorer设计合成三对特异的LAMP引物。然后通过对扩增温度、引物浓度、扩增时间、甜菜碱浓度等相关体系条件的优化,建立BHV-1的LAMP标准化检测程序,通过对该体系的特异性、敏感性和可视性等进行研究,最终建立BHV-1的LAMP检测技术。利用建立的检测技术对部分牛场43份来源于患有呼吸道疾病的病牛的鼻拭子样品进行B HV-1的检测,并与传统的PCR方法和病毒分离等方法进行比较,发现LAMP检测方法的检出率(19/43)显著高于传统的PCR方法(9/43),与病毒分离传代3次后的检出率较为相近(17/49),表明本研究建立的LAMP检测方法具有较高的实际应用价值,且具有耗时较少,检测时间较短等优点,面对国内蓬勃发展的养牛市场和匮乏的检测技术,将具有十分广阔的应用前景。