论文部分内容阅读
猪病毒性腹泻是我国猪场常见的多发病,其主要病原有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)。该类疾病的传染率和致死率都很高,同时各年龄阶段的猪均有感染的危险,严重威胁了养猪业的发展,因此研究有效的相关疫苗具有重要意义。本试验在前期关于PRV病毒VP7蛋白在烟草中表达的基础上进行更深入的探索,以烟草瞬时表达系统、烟草稳定表达系统和玉米胚乳特异性表达系统作为生物反应器,分别构建这几种病毒相关抗原蛋白的重组表达载体,采用农杆菌介导法转入受体植物材料,并进行蛋白表达检测,为进一步开发植物源病毒疫苗奠定基础。试验主要取得以下结果:(1)选取PEDV病毒纤突蛋白S上的主要抗原位点所在区域248-789位氨基酸,用烟草核偏爱密码子进行优化并由公司合成基因。根据受体植物材料不同,分别选取植物35S启动子和玉米14kD Zein启动子,成功构建了pBI121-S植物表达载体和pBI121-pZein::S玉米胚乳特异性表达载体。用电击法将载体转入农杆菌GV3101中,再用农杆菌侵染法构建植物转基因再生体系,分别将S基因转入普通烟草叶盘和玉米胚乳愈伤组织中。经筛选和诱导培养,获得再生抗性植株。(2)以普通烟草为材料,用优化的瞬时表达系统对PRV病毒中和抗原和血凝素抗原的融合蛋白VP4-7进行转化,提取侵染后的烟草总蛋白并用镍柱纯化,纯化前后的蛋白我们分别进行了SDS-PAGE和Western Blot分析。用His-tag抗体进行检测,总蛋白Western的结果显示目的蛋白获得了表达,纯化后的结果显示蛋白的大小发生了变化。(3)选取TGEV病毒纤突蛋白S上的抗原位点所在区域1-543位氨基酸,用烟草核偏爱密码子进行优化并由公司合成基因。成功构建了pBI121-TS植物表达载体,为后续植物疫苗的研究奠定了基础。